分子生物学1

分子生物学

姓名：曹晶晶 专业：神经生物学 学号：104753130913

1．请举例说明表观遗传研究的最新进展？

表观遗传指DNA 序列不发生变化，而基因表达发生可遗传改变的现象。表观遗传学改变包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 作用等，产生基因组印记、母性影响、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活等效应。 DNA 甲基化：是DNA甲基转移酶（DNMT）将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到DNA 双链中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNA甲基化在生物体内有多方面的重要生理意义。正常的甲基化对于维持细胞的生长及代谢等是必需的，具体的体现如维持染色质结构、基因印记、X 染色体失活、细胞分化和胚胎发育等。而异常的DNA 甲基化则会引发疾病（如肿瘤），因为异常的甲基化一方面可能使抑癌基因无法转录（如在很多肿瘤组织中p53 基因发生了高度甲基化），另一方面也会导致基因组不稳定（如5-mC 在脱胺反应中转化为胸腺嘧啶，如没有及时修补，就会发生基因变异，引发可遗传疾病）。显然，研究DNA甲基化对于了解生物生长发育及疾病治疗是非常有帮助的。在将来的研究中，如果可以去除基因治疗过程中细胞对外来基因的甲基化，将会增加提高疾病治愈的机会。 组蛋白甲基化：组蛋白甲基化通常发生在组蛋白H3 和H4 N-末端的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）残基上，另外组蛋白的球状结构域有时也会被甲基化，如组蛋白H3 的79 位赖氨酸（表示为H3K79me）会被DOT1L 催化发生反应。根据每一位点甲基化的程度不同，组蛋白甲基化形式可被分为单甲基化、二甲基化和三甲基化。基于甲基化位点和受作用基因的不同，组蛋白甲基化对基因表达的影响也不同。催化组蛋白甲基化的HMT 主要分为两大类：一类是含有保守的SET

（suppressor of variegation，enhancer of zeste，trithorax）催化结构域的蛋白家族（如SUV39 蛋白家族），广泛存在于真核生物细胞内；另一类不含该结构域（如催化赖氨酸甲基化的甲基转移酶DOT1L）。与HMT 作用相反的HDM最初由Shi 等发现。研究发现HMT 和HDM 可与同一个蛋白复合体结合，组蛋白是否被甲基化很大程度上直接取决于这个蛋白复合即时结合的对象。因此，HMT 和HDM 的表达、活性和招募都会改变组蛋白的状态，从而改变转录平衡。在很多基因敲除小鼠实验中已经发现HMT 基因的缺失会严重影响小鼠的发育，HMT 的错误调节会导致疾病的发生。目前已经发现了人类基因组中编码了大约50 种精氨酸和赖氨酸HMT，而其中至少有22 种与癌症或其他疾病相关。 基因印记：在肿瘤研究中发现，印记缺失是引起肿瘤最常见因素之一。对鸡的DNA 甲基化所致基因组印记效应的研究发现，在L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶（GATM）基因的第8 内含子内有差异甲基化区域（DMR）， 经亚硫酸氢钠测序法分析表明，6d 胚胎的雄性原始生殖细胞（PGC）比雌性的甲基化水平高出1.6 倍。由于肌酸生物合成中的问题会导致严重的神经学缺陷等病症，这样的表观遗传修饰必定需要精细调控。这种GATM 雌雄差异甲基化状态下的双等位基因表达对揭示基因组印记的机理很有意义。

母性效应：有名的例子是椎实螺（pond snail）的螺壳，有左旋和右旋之分，旋转方向的遗传符合母性效应。最新研究表明，椎实螺交配前行为的偏好性与其螺旋方向（手征性，chirality）相关；不仅如此，脑结构的镜像性分化和整个身体结构的不对称布局也是发育早期形成的，而且都与螺壳手征性的发生有关，很明显是由母性效应基因座位决定的。母性效应常与印记效应相关，研究表明相关基因的差异性甲基化、磷酸化以及选择性的蛋白互作与母性效应的形成和维持有很大关系。

基因沉默：相关研究表明，端粒重复RNA区域（TERRA）是控制异染色质和端粒酶的因素，在端粒中，DNA 结合蛋白Rap1 的C 端结构域可招募Sir2/3/4 和Rif1/2（Rap1-interacting factor 1/2）复合物，进而造成基因沉默，促进Rat1- 核酸酶依赖性TERRA 降解。基因沉默一方面是遗传修饰生物实用化、商品化的障碍，另一方面也是生物抗逆性（如植物抗病毒）的重要反应，为植物工程育种等提供了策略（例如RNA 介导病毒抗性技术的发展）。 核仁显性:近期有人分析了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）性染色体中的核仁显型现象，证明果蝇中的核仁显型只部分地依赖于已知的异染色质基因沉默， 而另外还有作用于rRNA基因的明显不同的异染色质调节方式，rRNA 基因阵列的大规模组织形式在其中发挥了重要作用，这也是有关果蝇等位基因失活研究揭示的首例成果。由于核仁显型，杂交动植物中整组亲代rRNA 基因可能被关闭； 核仁显性机制与癌症等疾病的某些失控机制有相似性，因而在医学方面也有重要的研究意义。 研究表明，原癌基因CSF1R 的转录可激活MaLR 基因家族的内源长末端重复（LTR）信息，即“垃圾DNA”产生了特殊活性。这对于霍金奇淋巴癌之类肿瘤细胞的生长起到了推波助澜的作用。生物的生理和发育过程均具有明显的全息特性，一种过程往往联系着另一种过程。李艳等研究了比H3K9me2 更特异的X 染色体失活修饰H3K9me3 的细胞学现象后，近期又证明这样的表观遗传标记在肿瘤发生中失去特异性。

2.DNA载体分为哪几种？构建载体的方法有哪些？

载体：通过不同的途径将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。根据其特征分为：（1）质粒，（2）单链DNA噬菌体M13，（3）λ噬菌体的衍生物(4)柯斯质粒，(5)动物病毒。根据其工程分为：克隆载体，表达载体和穿梭载体。

pBR322质粒的大小为 4361bp ， GenBank 注册号为 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自 pMB1。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。利用四环素抗性基因内部的 BamHⅠ 位点来插入外源 DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。 pUC18 和 pUC19

pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ （MSC） 来自 M13mp18/19 这两个质粒的结构几乎是完全一样 的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。 pUC118 和 pUC 119

由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为 3162bp ， GenBank 注册号为 U07649（pUC118）和 U07650（pUC119）。相当于在 pUC18/19 中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。

pGEM-3Z/4Z

pGEM-3Z/4Z由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为 2.74kb, GenBank 注册号为 X65304（pGEM-3Z, 2743bp）和 X65305（pGEM-4Z, 2746）。与 pUC18/19 相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如 Sp6 和 T7 噬菌体的启动子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了两个启动子的位置。

传统的载体构建方法

质粒载体DNA在体外经限制性内切酶酶切，然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环，最终得到转化载体。在此过程中，一般的步骤是，先在具有多克隆位点的初步载体上寻找合适的酶切位点，得到入门载体。为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接，中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作

Gateway技术是它利用位点特异重组构建入门载体(entry clone)后不再需要使用限制性内切酶和连接酶，而且一旦拥有了一个入门载体，就可以利用它将目标基因多次转移到各种不同的表达载体(目的载体，destination vector)上。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不会影响不同基因的测序结果，因而每当使用一种新的表达系统时，可以节省大量时间。Gateway技术是一种通用性的克隆方法，利用该技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中，用于基因的蛋白质表达和功能分析 Gateway技术以 噬菌体的位点特异性重组体系为基础，只需BP和LR两个反应就可以完成载体的构建。BP反应旨在将目的基因从目的载体或PCR产物重组进入供体载体(d0．nor vector)。创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因插入门载体，然后混合含有目的基因的入门克隆与合适的目的载体，以及Gateway LR Clonase酶，得到所需的表达克隆载体，在合适的宿主中，表达克隆就可以用来进行蛋白的表达和分析。

含三段T—DNA载体：共转化法就是利用基因枪介导将分别携带目的基因和标记基因的二个质粒载体混合转入受体细胞中，之后即可在T1或rI2的分离后代中获得无筛选标记的转基因植株，不足的是转化频率比较低 。利用分别含有不同双元表达载体的农杆菌混合侵染植物细胞 ，同时含有二个不同双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞 或含有二段T—DNA双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞。由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T—DNA上，后代中能够获得无标记转基因植株，获得频率同样比较低。叶兴国等研究构建了包含三段T—DNA的双元表达载体，其中的一段T—DNA区域含标记基因，另外二段T—DNA区域含目标基因，用其转化大豆后较高频率获得了无标记转基因植株。

一种通用高效的复杂载体构建新方法：，在目的片段5’端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用r4 DNA聚合酶3’一5’外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。七个片段拼接的表达载体pRSMGA的构建，只需做两次连接转化就可以完成，且其重组转化效率高。