实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶（预习报告）

生物化学实验预习报告

实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析

小麦幼苗过氧化物酶同工酶

一、研究背景

电泳现象就是带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极泳动。电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，自此生物大分子的分离纯化便进入了电泳技术的新时代。电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上又一次伟大的飞跃。人们清楚地意识到，要想使目标物得到分离，目标物与杂质之间的性质差异必须足够大，这又与某些性质差异小的物质的分离相矛盾，而人为放大这些差异小的性质必然会破坏目标物的原有结构，因此需要借助第三者进行差异转化，即以其自身的性质为基础，转化为其他方面差异大的性质。电泳技术就是利用一些生物大分子的电性特点，在一定的条件下使被分离物之间很小的差异转化为自身所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作用下便会体现出迁移速度上的差异，通过时间上的积累进而体现为迁移距离的差异。最初的电泳技术是在溶液中进行的自由电泳，后来人们想到，由于待分离物的大小、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻力，这种阻力的差异又转化为了电场中迁移速度的差异，所以人们便发明了各种用于电泳的载体（支持介质），大大提高了分辨率。至此，电泳技术的基本理论就建立了。此后，在实际操作中，人们不断进行探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为一项生物大分子分离纯化中令人瞩目的研究技术。与层析法相比，电泳技术更为充分的综合利用了分子大小、带电情况、形状差异等性质差异，更能特异性地进行分离纯化。

本实验基于电泳的基本原理对小麦过氧化物酶同工酶进行分离，旨在学习并体会电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解一项新技术在实际应用中不断修正与完善的过程。

二、研究目标

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的基本原理以及具体用于分离生物大分子的操作过程；

2.掌握植物体中的过氧化物酶同工酶的高效分离方法与检测技术； 3.验证电泳技术的理论可行性与实际可操作性，进一步体会电泳技术的发明历程以及对生物大分子分离纯化的推动作用。

三、研究策略

同工酶在植物体内普遍存在，可取小麦不同器官进行提取，随后采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板不连续电泳对两个样品中同工酶进行分离，最终通过特定的染色反应显示出酶的不同区带，分析比较小麦不同部位中过氧化物酶同工酶种类与含量的差异。

四、研究方案及可行性分析

1.研究方案

（1）过氧化物酶同工酶

同工酶是催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，测定同工酶在理论上和实践上都具有重要的意义。本实验测定的过氧化物酶同工酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物的光合、呼吸作用以及生长素的氧化等有关；在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定过氧化物酶同工酶的生物活性可以了解某一时期植物体内代谢的变化。

（2）电泳技术的特点

1凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，2所需样○并可进行定性或定量分析；○

3设备简单、操作简便、分辨率高○4便于观察、记录和保存。 品量极少；○

（3）电泳的基本原理

带电粒子在电场中的泳动速度有以下公式： v=

????6??????

由此可以看出，粒子移动的速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电量成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。此外，粒子的移动速度还与形状有关，即非球形粒子（如线形DNA分子）在电泳中会受到更大的阻力。

不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，为了便于比较，常用泳动度或迁移率（m）来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下：

m= =

????

??6??????

由上式可以看出，迁移率m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液粘度有关，而与电场强度无关。

又因为氨基酸、蛋白质、酶等的电离度α随着溶液pH的变化而变化，所以在实际点臃肿，常使用有效迁移率这个概念，有效迁移率（μ）定义为迁移率（m）和当时条件下电离度α的乘积。即：

μ=m·α=

??.??6??????

2.可行性分析

（1）区带电泳技术方便，并且所分离的物质集中在某一特定的带状区域内，减少了界面异常现象以及样品扩散程度，有利于最终的回收。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用性强，该种凝胶机械性能强、化学性质稳定，弹性好，透明，对于pH及对温度变化不敏感，且是由非离子型分子构成的聚合物，无吸附及电渗作用，可以根据不同的浓度改变交联度（光化学法和化学法）根据需要制成不同孔径的凝胶，适用范围广泛。

1表面积大，易冷却控制温度；○2电泳后易（3）本实验采用垂直板电泳，优点在于：○

3可在同一电板上同一操作条件下，4可做双向电泳；○5便取出凝胶；○同时比较多个样品；○

于保存及利用各种鉴定方法。

（4）采用不连续电泳，先浓缩后分离获得的分离效果更为明显。充分利用了分子筛效应、电荷效应以浓缩效应。

（5）样品的检测与分析

过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。

综合以上各点，本实验具有较大的可行性。

五、具体实验设计

1.实验仪器及试剂

仪器：电泳仪一套（稳压电源及垂直板电泳槽）、高速离心机（10000r/min）； 器具：烧杯50ml×4、100μl微量进样器、大培养皿一套； 材料：小麦幼苗； 试剂：见下表 序号 1 2 试剂名称 2%琼脂 分离胶缓冲液 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) 浓缩胶缓冲液 3 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) 4 5 6 7 8 9 分离胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅰ) 浓缩胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅱ) 过硫酸铵溶液（Ap） 电极缓冲液 (pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液) 40%蔗糖溶液 pH4.7乙酸缓冲液 样品提取液 10 11 12 13 (pH8.0 Tris-HCl缓冲液) 0.5%溴酚蓝溶液 联大茴香胺染色液 四甲基乙二胺（TEMED） 0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。 联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95%乙醇中，加20 mL蒸馏水，使用前加3% H2O2 4～5 mL（当天配制） 原液 Tris 12.1 g，加无离子水1000 mL，以HCl调节pH至8.0 配制方法 2g琼脂，100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。 取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。 Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。 1g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。 Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1000 mL，用时稀释10倍。 蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。 乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定容至1000 mL。 2.实验步骤

（1）贮液配制（教师完成）按上表配制贮液，但应注意

A.配好的丙胶贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放1~2个月； B.过硫酸铵应当天配制； C.如有不溶物应过滤； D.染色液应当天配制；

E.电极缓冲液用时稀释10倍。

（2）凝胶的制备

A.将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液；

B.安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片； C.用2%的琼脂糖封底，以防漏胶； D.按下表所示配制分离胶（20min） 名称 用量（ml） 分离胶缓冲液 1.3 分离丙胶 2.7 无离子水 6.0 TEMED 0.040 过硫酸铵 0.4 在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用手扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，小心倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2cm左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2~3mm厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿（此过程大约10min），便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。

E.按下表所示配制浓缩胶（20min） 名称 用量（ml） 浓缩胶缓冲液 0.5 浓缩丙胶 1.0 无离子水 2.2 TEMED 0.015 过硫酸铵 0.2 配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片0.5cm左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。此过程大约15min。

（3）样品的制备（20min）

小麦幼苗叶片1g→ pH8.0样品提取液2ml，冰浴中研磨→用4ml提取液洗入离心管→ 8000rpm离心10min→倒出上清，等量40%蔗糖溶液混合

同上述操作，制备根部的样品液 （4）点样（5min）

样品液中加入1~2滴溴酚蓝→微量进样器点样（梯度上样，每种5μl、15μl、30μl、50μl） （5）电泳（3.5h）

接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）→控制电流（浓缩时15mA，分离时25mA）→指示剂到末端0.5~1cm处停止。

（6）剥胶、染色及记录结果（35min）

将凝胶置于大培养皿中，进行染色反应（浓缩胶可以去掉）。

染色过程如下：

A.向大培养皿中倒入约50ml pH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10min。 B.倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20min，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，待染色条带充分显色后观察记录酶谱并分析结果。

3.实验所需时间预计

整个实验预计所用时间约为5.5h。

六、质疑及相关思考