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使用溶液:一份福林试剂与一份水混合，摇匀。 8.福林-酚甲液

a．称取1.000g无水碳酸钠粉末，溶于50ml0.1 mol/LNaOH溶液配制成B液。此溶液需现用现配。

b．称取1.000g硫酸铜，用蒸馏水定容至100ml，即得到1%的硫酸铜溶液。

c．称取2.000g酒石酸钾纳，用蒸馏水定容至100ml，即得到2%的酒石酸钾纳溶液。

等体积混合1%的硫酸铜溶液和2%的酒石酸钾纳溶液，移取1ml于B液中，即得到福林-酚甲液。 9.茚三酮显色剂

称取茚三酮0.5g，果糖0.3g、Na2HPO4·10H2O10g及KH2PO46g，用蒸馏水定容至100ml。 10.乙醇溶液

量取40ml无水乙醇，加入60ml蒸馏水混合，即得到40%乙醇溶液。 11.盐酸溶液

(在通风橱中操作)量取4.5ml原装弄Hcl，倒入装有半瓶水的500ml试剂瓶中，加蒸馏水稀释定容至500ml，充分摇匀。 12. Tris-Hcl缓冲液（PH=8.2）

量取50ml0.1mol/l三甲基氨甲烷溶液，加入22.9ml0.1mol/l盐酸，用蒸馏水定容至100ml。 13.三甲基氨甲烷溶液

称取0.6057g三甲基氨甲烷溶液，用蒸馏水定容至50ml。 14.邻苯三酚溶液

称取0.0378g焦性没食子，用10mmol/lHCL定容至100ml。 15.亚油酸储备液

量取15ul亚油酸溶于50ml0.2mol/l磷酸盐缓冲液中，10000r/min均质10min，使溶液呈乳白色，0℃保存，24小时内使用。 16.FeCl2-EDTA溶液

称取lFecl29.95g，EDTA18.6g用蒸馏水定容至1000ml。 17.乙醇(含0.3mol/LHCL) 溶液

量取75ml无水乙醇，加入0.3mol/LHcl25ml，即得到75%乙醇溶液(含0.3mol/LHCL)。 18. FeCl2溶液

称取lFecl29.95g用蒸馏水定容至500ml。 19.硫氰酸钾溶液

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称取40g硫氰酸钾, 用蒸馏水定容至100ml，即得到40%硫氰酸钾溶液。 2.2 检测方法

2.2.1 蛋白酶活力测定法—福林法[11]

（1）原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算酶活力。

（2）测定步骤

①标准曲线的绘制

按表2-1配制不同浓度的酪氨酸溶液

表2-1 a.L-酪氨酸标准溶液

管号 酪氨酸标准溶取100μg/ml取水的体积

液的浓度酪氨酸标准溶/ml /μg/ml 液的体积/ml

０ 0 0 10 １ 10 2 8 ２ 20 4 6 ３ 30 6 4 ４ 40 8 2 ５ 50 10 0

b.分别取上述溶液各1.00ml（须做平行样，2～3个），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，福林试剂使用液1.00ml，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长660nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

②测定各种酶活力

取15×100mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入样品稀释液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10 min后加入2.0 mL的4%三氯乙酸溶液终止反应，在40℃水浴锅中静置20 min后过滤。取1.0 mL滤过液，依次加入5.0 mL的0.4 mol/L Na2CO3溶液，1.0 mL已稀释的福林试剂，混合后于40℃水浴中静置20 min。在660 nm波长下以空白管做参比测定吸光度。空白管在加入酪蛋白溶液和蛋清溶液后，先加入三氯乙酸溶液再加入酶溶液。实验重复3次，数据取平均值。

酶活的计算如下：

在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个酶活力单位。

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样品蛋白酶活力单位（干基）=样品蛋白酶活力单位=

A1 ?4?N101?W式中，A ——由样品测得的OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或

OD值×K）；

4 ——4ml反应液取出1ml测定（即4倍）； N ——酶液稀释的倍数； 10 ——反应10min； W ——样品水分含量； K—吸光常数；

2.2.2 蛋白质含量测定法—福林-酚法[12]

用福林-酚法测定试样中的蛋白质浓度。

1.标准曲线的绘制

按表2-2配制不同浓度的酪蛋白标准溶液

表2-2 酪蛋白酸标准溶液

管号 酪氨酸标准溶取200μg/ml取水的体积

液的浓度酪氨酸标准溶ml μg/ml 液的体积ml

０ 0 0 1.0 １ 40 0.2 0.8 ２ 80 0.4 0.6 ３ 120 0.6 0.4 ４ 160 0.8 0.2 ５ 200 1.0 0

上表酪蛋白标准溶液与3 mL福林-酚甲液混合均匀，在25℃水浴锅中

静置10 min。再加入0.3 mL 1 mol/L福林-酚乙液迅速混合，在25℃水浴锅中静置30 min后,以介质溶液调零，在750 nm下，以不含酪蛋白的0管为空白，分别测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪蛋白的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

2.样品处理 取水解液6ml，沸水浴灭酶10min后，加入4%三氯乙酸2ml沉淀30min，然后4000r/min离心10min，取上清液1ml稀释50倍测蛋白质含量。 3.样品蛋白质的测定—福林-酚法[13] 1 mL样品稀释液与3 mL福林-酚甲液混合均匀，在25℃水浴锅中静置10 min。再加入0.3 mL 1 mol/L福林-酚乙液迅速混合，在25℃水浴锅中静置30 min后, 在750 nm下，以介质溶液调零，以不含酪蛋白的0管为空白，测定吸

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光度，根据作图或回归方程，与蛋白质标准液作对照，求出样品的蛋白质的含量。

本法在0～60mg/L蛋白质范围内呈良好线性关系。 利用标准曲线回归方程计算样液中多肽含量。

多肽得率(%)?样品蛋白含量(g/ml)蛋清液蛋白总含量(g/ml)?100%

2.2.3 水解度测定法—茚三酮比色法[13] (1)标准曲线的绘制

取0.1000g干燥过的甘氨酸溶解后定容至100ml，取出2.00ml定容至100ml得20μg/ml的溶液。取此液再分别稀释成含量为2-20μg/ml的溶液用于标准曲线绘制。取2.00ml测定用稀释液于试管中加入1.00ml显色剂，混匀后沸水浴中加热15min，同时作空白试验;然后冷水冷却，加入5.00ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。以吸光度A为纵坐标，甘氨酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

表2-3 甘氨酸标准溶液

管号 甘氨酸标准溶液的含量/μg 取显色剂的体积/ml

0 0 1 1 4 1

2 8 1

3 12 1

4 16 1

5 20 1

6 24 1

样液中一NH2基的测定：取样液2.0ml定容至100ml，取1.0ml稀释液于试管中并加入1.0ml蒸馏水、1.00ml显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min.同时作空白试验。以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算样液中一NH2的含量(μmol/ml)。

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