Transwell试验方法

Transwell细胞侵袭实验与移动实验

一、试剂和耗材 1) 2)

细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10?S的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。 10×PBS (pH7.0)：

Na2HPO4·12H2O （MW 358.4） 2.87g KH2PO4（MW 136.09） 0.2g NaCl（MW 58.44） 8.0g KCl（MW 74.55） 0.2g 去离子水至 100 ml

高压灭菌后，室温保存。使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。 3) 4) 5) 6)

冰乙酸:甲醛（1:3）

Transwell小室 (BD, Bioscience)

Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。

各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20oC预冷，备用。 7) 8)

5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad） 细胞计数板、6孔板

二、实验步骤 （一）侵袭实验 1.

润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。 2.

细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培

养24h。 3. 1)

细胞的接种：

弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min以内。 2)

加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心5min； 3) 4)

弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；

弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数； 5) 6)

计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；

将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl（含5×104细胞）逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。 7) 4. 1)

将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。 细胞染色及拍照：

弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快速完成，避免让小室的膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul固定液，固定5-10分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。 2)

弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500ul苏木素染液的培养孔中，上室中加入200ul固定液，染色10-15min。 3) 4)

将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。 往小室内加入100ul PBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200× 光镜下计数10个视野的侵袭细胞数,取其平均值,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。 5)

若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。

（二）移动实验 1.

小室润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min，备用。

2. 细胞准备：常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3次后，加入常规量无血清培养基

饥饿12h。 3. 接种Transwell小室 1)

弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1分钟以内。 2)

加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心五min； 3)

弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数； 4) 5)

计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；

将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。 6)

将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。

4. 细胞染色（Giemsa试剂盒）及拍照：

（三）Transwell小室重复利用处理方法

1． 拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温

放置过夜（约6h以上）；

2． 将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色； 3． 无菌水漂洗几次以除去残留物质，甩干水后，置于室温自然晾干；

4． 再次使用之前，将晾干的小室及所用的细胞板置于超净台紫外下除菌，小室正反面各照射30min。

注：小室可重复利用多次，但在棉签擦拭的时候力度避免过大，以免损伤小室膜；重复使用之前可观察小室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。