生物技术制药期末总结

过多的泡沫会给发酵带来负面影响： ①降低生产能力；

②大量气泡引起“逃液”，造成原料和产物的损失； ③影响菌体呼吸；

④泡沫使部分菌体黏附在罐顶或罐壁上，使发酵液中菌体量减少； ⑤泡沫升至罐顶，顶至轴封或逃液，增加染菌机会； ⑥消泡剂的加入会给提取工艺带来困难。 六，疫苗

疫苗（vaccine）：主要是指将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗等。

1796年，Jenner进行了第一个预防天花人体实验,诞生了世界上第一个疫苗。 四次疫苗革命

十九世纪末，以疫苗之父巴斯德为代表，先后研制成减毒炭疽、霍乱及狂犬病疫苗，形成了第一次疫苗革命。 1962年，基因重组疫苗开始出现，并于1986年诞生了乙肝表面抗原疫苗，被称之为第二次疫苗革命； 1992年，Tang报道了基因疫苗，引发了第三次疫苗革命； 2000 年利用反向疫苗学研制疫苗，引发了第四次疫苗革命。 核酸疫苗又称基因疫苗，DNA疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，直接导动物细胞内，从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到免疫的目的。 治疗性疫苗(Therapeutic vaccine)是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品

反向疫苗学（reverse vaccinology ）是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原的疫苗发展策略。它以微生物基因组为平台，对毒力因子、外膜抗原、侵袭及毒力相关抗原等蛋白基因进行高通量克隆、表达，纯化出重组蛋白。然后，再对纯化后的抗原进行体内、体外评价，筛选出保护性抗原，进行疫苗研究。

疫苗的组成

抗原 稳定剂 佐剂 灭活剂 防腐剂 缓冲液、盐类等非活性成分

佐剂Adjuvant ：是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂可以具备免疫原性，也可无免疫原性。 作用：

（1）增加抗原的表面积，从而增强抗原的免疫原性；

（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；

（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能； （4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。 抗原的选择要求

免疫原性好

表面暴露：易于接触机体免疫系统 特异性好：减少交叉反应 容易获得 功能重要

抗原的改造和优化 常用方法

截短表达：去除信号肽和跨膜区，免疫优势区域或优势表位； 融合表达：两个或多个蛋白融合表达，抗原与佐剂融合； 突变构建：去除抗原的生物学活性但保留免疫原性。 可用于人体的佐剂：

铝佐剂（Al(OH)3，AlPO4）

MF59：一种水包油的乳剂，包含1%鲨烯，0.5%Tween80 和0.5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。被用于诺华公司的流感疫苗复立达中。

AS04：用于HPV疫苗

免疫程序内容

初次免疫起始月（年）龄 接种间隔 接种剂量 加强免疫 接种途径 联合免疫和几种疫苗同时接种 接种次数 七，抗体工程

抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）以抗体的分子结构为基础，抗体的免疫效应功能为核心，利用基因工程、细胞工程和转基因技术生产抗体类生物诊断制剂和治疗药物。

多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。

单克隆抗体（McAb）由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。

杂交瘤技术的基本原理：通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。 单克隆抗体的制备技术 （一）单克隆抗体的产生

（二）单克隆抗体的纯化

（三）单克隆抗体的性质鉴定 基因工程抗体的主要类型：

? 人源化抗体 ? 双特异性抗体 ? 小分子抗体 ? 抗体库技术 ? 抗体融合蛋白

小分子抗体:具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。 优点：

1）可在原核细胞表达，生产成本低; 3）不含Fc 段，副作用小； 2）易于穿透血管或组织到靶细胞部位； 4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。 小分子抗体包括：

① 抗原结合片段（fragment of antibody binding,Fab）：由一条完整的 L 链和约为1/2的 H 链组成，是完整抗

体 的 1/3，只有一个Ag 结合位点，它是将 McAb 重链V区和 CH1 区cDNA 与完整轻链 cDNA 连接，在细胞启动子的控 制下分泌表达。

② 可变区片段（fragment of variabie region,Fv）：是由L链和H链的V区组成的单价小分子，是与抗原结合的

最小功能片段。

③ 单链抗体（single chain Fv,ScFv）用适当的寡核苷酸街头将L链和H链的V区（ VH 和 VL）连接起来，

使之形成单一的多肽链，称为单链抗体（ScFv） 。为单一抗原结合位点。

ScFv的优点是：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。

缺点是：无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。

噬菌体展示技术（phage display）将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。

噬菌体展示在抗体库技术中的应用

? 在基因III 蛋白和基因VIII蛋白末端插入外源蛋白，表达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，不影响噬菌体的

功能，因而gp3和gp8被应用于噬菌体展示（phage display）。

? 基因VIII蛋白在噬菌体颗粒外壳上有2700个拷贝，N-端1~5个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白，

但外源肽段多于十肽时会影响gp8的功能。

? 基因III蛋白在噬菌体颗粒外壳上有3-5个拷贝，将外源基因紧靠基因III上游，在噬菌体表面表达融合蛋白，

不影响噬菌体的功能。

八，酶工程

酶工程(Enzyme engineering)由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。是从应用的目的出发，研究和利用酶的特异性催化功能，通过适当工艺将相应的原料转化为有用物质。 固定化酶（细胞）Immobilized Enzyme (Cell) :是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶（细胞），能连续地进行反应，反应后的酶（细胞）可以回收重复使用。固定化细胞，能继续增殖、休眠和死亡，但其酶活性保持不变。 固定化酶（细胞）的制备传统方法 1.载体结合法： 酶+不溶性载体 作用力 常用载体 物理吸附法 范德华力、氢键、疏水力、静电 氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷等 离子结合法 离子键 共价结合法 共价键 DEAE-葡聚糖凝胶、DEAE-纤维纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶,素，等 等。 优 点 反应温和，工艺简便，选择范围大，条件温和，操作简便，酶活力损结合较牢固，有良好的稳定性及重复酶活影响小。 失少。 使用性。 结合力弱，易脱落，污染催化反应产结合力弱，易解吸附。 物。 反应剧烈，固定化酶活性损失严重。 缺 点 2.交联法

利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化法。 区别：不使用载体。 3.包埋法

将载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，实现酶固化的方法。

固定化细胞的方法

化学交联法，絮凝法载体粘合法、凝胶体截留法和金属螯合法等多种。 固定化酶（细胞）的性质和指标 （一）固定化后酶活力的改变

①空间构象变化，影响活性中心的氨基酸； ②空间位阻，影响对底物的定位作用； ③内扩散阻力使底物分子接近受阻；

④包埋时受半透膜包围，大分子底物不能透膜与酶接近 （二）固定化对酶稳定性的影响 ①热稳定性提高

②对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高

③对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高 （三）固定化酶的最适温度变化

热稳定性提高，最适温度也随之提高。 （四）固定化酶的最适pH变化

对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线偏移 （五）固定化酶的米氏常数（Km）变化

Km：酶动力学参数，由酶和底物相互关系决定。 Km值↑，酶和底物亲和力↓。

Km变化又受溶液中离子强度影响。 （六）固定化酶（细胞）的指标

固化后，其催化功能由均相体系反应变为固-液相不均一反应，酶的催化性质发生改变。

1. 酶（细胞）的活力：是指固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。umol / min?mg（每毫克干重固化酶每分钟转化底物或生产产物的量） 2. 偶联率及相对活力的测定

偶联率=(加入酶蛋白活力-上清液酶蛋白活力)／加入酶蛋白活力×100% 偶联率＝1，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显； 偶联率＜1，扩散限制对酶活力有影响；

偶联率＞1，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。

3. 固定化酶（细胞）的半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1／2表示。半衰期是衡量稳定性的指标 4. 固定化酶的热稳定性

将固定化酶在不同温度下温育1小时之后，在最适温度下测酶活力。固定化酶的活力一般应保持在60%以上。 九，新型生计 研究热点：

蛋白质和蛋白质复合物的结构功能 蛋白质在细胞内的动态变化 特定蛋白质在活体内的功能 全蛋白谱研究

蛋白质相互作用的图谱 基于蛋白质的药物设计

反义核酸：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通过碱基互补原则与细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能。

RNA干扰：RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。

基因治疗Gene therapy：

经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。

广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。