显微技术实验

实验三 放线菌和霉菌形态的观察

实验目的：

掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征。

实验原理：

放线菌是指能形成分枝丝状体或者菌丝体的一类革兰氏阳性菌,常见的放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称基丝),基丝长到一定程度还能向空气中生长出气生菌丝(简称气丝),并进一步分化产生孢子丝以及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据 观察放线菌的形态特征常用扦片法、玻璃纸法、印片法。

霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。

观察霉菌的形态主要有三种方法，A直接制片观察法：是将培养物放置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，其制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保存较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树脂封固，制成永久标本长期保存。B载玻片培养观察法：用无菌操作将培养物琼脂薄层放置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这中方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育时期的培养物。C玻璃纸培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌玻璃纸培养观察方法相似。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。

实验器材：

1.菌种 细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）或青色链霉菌（Streptomyces glaucus），弗氏链霉

菌（S. glaucus），曲霉 (Aspergillus sp.) ，青霉 (Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2-5天的马铃薯琼脂平板培养物。

2.溶液或试剂 高氏Ⅰ号琼脂培养基、，乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇、20%的甘油等。

3.仪器或其他用具 灭菌的平皿、玻璃管、盖玻片、玻璃棒、载玻片、接种环、接种铲、镊子、显

微镜、U型玻璃棒、解剖针。

实验内容：

（一）放线菌观察

1. 放线菌自然生长状态的观察

(1) 将灭菌后的高氏1号培养基倒入培养皿，每皿倒15mL左右，凝固后备用。

(2) 用经火焰灭过菌的小镊子将灭菌过的优质玻璃纸平铺在平皿培养基上，如果琼脂培养基和玻璃

纸之间有气泡，可以用灭过菌的玻璃棒将气泡除去。

(3) 将3～5mL无菌水倒入链霉菌的斜面培养物里，制成菌悬液，再适当稀释。

(4) 用无菌吸管取0.1mL的孢子悬液稀释液，接种在玻璃纸上，并用无菌玻璃棒涂匀后，置28℃培

养，直到菌长好，备用。

(5) 在洁净的载玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分

开，再用剪刀剪取小片长有菌的玻璃纸，菌面朝上放在载玻片的水面上，使纸平贴在载玻片上。 (6) 将载玻片置显微镜下观察。

附：玻璃纸灭菌方法 在玻璃纸灭菌时，若直接将干燥的玻璃纸灭菌，它会缩小，发皱，不便使用。

故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。 2. 营养菌丝的观察

(1)用接种铲连同培养基挑取细黄链霉菌菌苔置载玻片中央。

(2) 用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥，固定。 (3) 用吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染液染0.5-1min，水洗。 (4) 干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。 3. 气生菌丝与营养菌丝的比较观察。

(1) 将高氏Ⅰ号培养基倒入无菌培养皿，制成4mm左右的培养基平板，经培养后无菌，备用。 (2) 用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45o倾斜角插入平皿培养基琼脂内，然后将细黄链霉菌的孢子

悬液（浓度以稀释10-2～10-3为好），接种在盖玻片与平皿培养基的界面上。

(3) 倒置于28℃培养4～5天后，小心的将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微

镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。 4. 孢子丝及孢子的观察

(1) 将培养3～4天的细黄链霉菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气

生菌丝和孢子丝的形态，注意分枝情况、卷曲情况等。

(2) 取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻的按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴吕

氏碱性美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片。用油镜观察孢子的形态，孢子丝等。

(3) 用小刀切取细黄链霉菌培养物一块（带培养基切下）。菌面朝上放在一载玻片上，另取一洁净载

玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）印在后一块载玻片的中央，注意不要使培养物在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰2-3次固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。 （二）霉菌观察 1.直接制片观察法

在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染色液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，放置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。 2.载玻片培养观察法

(1)培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略少于皿底的圆滤纸片，再放一U型玻璃棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖。包扎后121°C灭菌30min，烘干备用。

(2)琼脂块的制作：取已经灭菌的马铃薯琼脂培养基6－7mL注入另一个灭菌平皿中，使之凝固成薄层。解剖刀切成0.5－1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。

(3)接种：用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖再琼脂块上。

(4)培养：先在平皿的滤纸上加3－5mL灭菌的20%甘油(用于保持平皿内的湿度)，28°C培养。 (5)镜检：根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。

实验报告：

1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?

2．玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类型微生物的培养和观察?为什么? 3. 绘图说明你观察到的放线菌的主要形态特征。 4. 霉菌与放线菌形态区别。

实验四 酸奶中微生物及双歧杆菌口服液中微生物形态观察

实验目的

1.考察学生对微生物显微技术实验设计及实验操作程度 2.激发学生创造性学习能力 实验背景资料

1、乳酸菌: G+，杆菌或球菌，无芽孢，微须氧或厌氧，能发酵乳糖成乳酸。 2、乳酸菌的种类

旧菌名 新菌名 嗜温型

乳脂链球菌 乳酸乳球菌乳脂亚种 乳酸链球菌 乳酸乳球菌乳酸亚种

柠檬明串珠菌 肠膜明串珠菌乳脂亚种 丁二酮链球菌 乳酸链球菌丁二酮亚种 乳酸明串珠菌 嗜热型

嗜热链球菌 唾液链球菌嗜热亚种

保加利亚乳杆菌 德氏乳杆菌保加利亚亚种 乳酸乳杆菌 德氏乳杆菌乳酸亚种 瑞士乳杆菌

嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus 1.属性

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，但是益菌作用比较弱。 2.保健作用

调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖。嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拈抗作用。嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon)), 对肠道致病菌产生的拮抗作用。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简称A)和双歧乳杆菌(Bifidobacterium，简称B)混合组成的发酵剂。摄入含有这两种活菌的乳食品对消化器官有好处，特别是对胃肠功能失调的婴幼儿和一些长期口服抗菌素而引起胃肠功能失调的病人，食用含有这两种活菌的发酵乳后，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，所以具有很好的营养保健作用.

嗜热链球菌 1.属性

原核微生物链球菌细菌的一种链球菌Streptococcus：

兼性厌氧或微好氧的革兰氏阳性菌，过氧化氢酶反应阴性，圆形或椭圆形，成对或成链状，不产芽孢，多不运动。也有少数种厌氧. 2.保健作用

嗜热链球菌为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌活菌真正对人体起作用的是其乳发酵产物和底物。这些物质进入人体内，可以促进体内有益菌的增殖，抑制有害菌的繁殖，起到整肠及抗菌作用.

3.嗜热链球菌的形态

嗜热链球菌，卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性，受培养基和培养温度影响较大。在原乳中：45度乳中形成链状，30度时多数菌株形成双球菌。在高酸度乳中变成长链。嗜热链球菌与人类的关系密切。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。嗜热链球菌又是近年用微生物法检测牛奶中抗生素残留的首选菌种之一。

干酪乳杆菌

干酪乳杆菌存活的pH范围是2.5－3.5之间，这与人体正常的胃酸值3.0非常接近，可见干酪乳杆菌不但能较长时间存活于乳酸饮料中，而且能通过胃酸的考验而进入肠道的消化系统，真正起到益生的作用。并且实验证明，蛋白小肽可作为一种益生菌因子，促进干酪乳杆菌在大肠内的生长

实验步骤

1. 完成实验设计，形成实验预习报告

2. 指导教师批阅预习报告，并就报告内容提出参考意见 3. 进行实验，记录实验结果 实验总结