生物化学实验讲义

1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？

实验三 紫外吸收法测定核酸的含量

一、实验目的：

学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 二、预习要求：

要求预习实验讲义。 三、实验原理：

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双键系统（－C＝C－C＝C－），能够强烈吸收250－280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 四、实验设备与器材： 仪器：

分析天平、紫外分光光度计、冰浴或冰箱、离心机、离心管（10mL）、烧杯（10mL）、容量瓶（50mL、100mL）、移液管（0.5mL、2mL和5mL）、药品勺和玻璃棒、试管和试管架等； 试剂：

1、5%~6%氨水：用25%~30%氨水稀释5倍。

2、钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水。 3、核酸样品DNA或RNA。 五、实验内容与步骤： 1．核酸样品纯度的测定

（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容至50mL。

（2）取两支离心管，甲管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；乙管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度。

（3）计算

如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。

2．核酸溶液含量的测定

当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度作为对照。

（1）取2支离心管，每管各加入2mL待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL蒸馏水，向乙管内加2mL沉淀剂。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3 000r/min离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0之间。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度OD260nm。

（2）计算

六、 思考题：

1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？ 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？