综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定

综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测

定

（一）实验目的

学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用3.5－二硝基水杨酸法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。

（二）实验原理

本实验采用Bradford法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定蛋白浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在OD465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为OD595nm，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法高近4倍，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在10~100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。

本实验采用DNS法[11]测定，属于染料结合法的一种。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。

蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的1,2-糖苷键裂解，释放出等量的D-葡萄糖和D-果糖[12]。每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5－二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸（图1）。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，可利用分光光度计进行比色测定，查对标准曲线，求得样品中的含糖量。

O2NCOOHOHCOOH加热+ 还原糖碱性O2NOHNO2NH2

图1 3,5－二硝基水杨酸还原反应

（三）实验仪器、材料及试剂

1.仪器

（1）722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱 （2）量筒、容量瓶、移液器、试管。 2.材料及试剂

（1） 考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙

醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1L。 （2） 5%蔗糖 （3） 1mg/ml葡萄糖 （4） 0.9% NaCl溶液

（5） 人血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：人血清蛋白标准液，用0.9% NaCl溶液溶解并

稀释至0.1mg/ml 。

（6） DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂配制：准确称量12.6g 3,5-二硝基水杨酸，量取

524mL 2mol/L NaOH溶液，加到1000mL含有370g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O，MW=282.22）的热水溶液中（预热至50℃左右），再加10g结晶酚和10g亚硫酸钠（NaS2O3），搅拌溶解，冷却后移入2000mL容量瓶中用蒸馏水定容至2000mL，贮于棕色瓶中避光，4℃保存，于2周内使用，使用过程中尽量减少与空气接触。 （7） 0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH5.0）：

（a）0.2mol/L NaAC：称取2.7616g NaAC溶解并定容至100ml。 （b）0.2mol/L HAC：10ml乙酸(分析纯)定容至50ml。 将两者分别取63ml、37ml混合成100ml，用强碱调pH到5.0。

（四）操作步骤

1. 各级分蛋白质浓度测定

（1） 蛋白质浓度测定――标准曲线

取8支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀，记录A595nm 值。以吸光度值为纵坐标，

各管蛋白含量(μg/ml)作为横坐标绘制标准曲线。

表1考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制

试剂(ml) 0.1M标准蛋白液

0.9%NaCl 考马斯亮蓝G250

blank 0 1.0 4.0

1 0.1 0.9 4.0

2 0.2 0.8 4.0

3 0.3 0.7 4.0

4 0.4 0.6 4.0

5 0.5 0.5 4.0

6 0.6 0.4 4.0

0.7 0.3 4.0

7

充分混匀上述各管，室温静置5min，以空白管溶液调T=100%，读取各管的吸光度值。

（2）各分级蛋白浓度的测定

各分级酶液先稀释一定倍数，然后按照表2所示，取4支干净试管加入各组试剂，测量的吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜。

表2 考马斯亮蓝法测定各分级蛋白浓度（N=稀释倍数）

试剂(ml) 酶液 0.9%NaCl 考马斯亮蓝G250

粗酶液Ⅰ(N1)

0.2 0.8 4.0

粗酶液Ⅱ(N2)

0.2 0.8 4.0

粗酶液Ⅲ(N3)

0.2 0.8 4.0

充分混匀上述各管，室温静置5min，以空白管溶液调T=100%，记录各管A595nm 值。查标准曲线即可求出蛋白质含量。注意：稀释后的各管吸光度值应在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜。 2. 各分级蔗糖酶活性的测定

（1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线

取9支试管，按表3加样，将各管溶液混匀后，进行比色测定记录A520nm吸光度值。以还原糖浓度（μmol/ml）为横坐标，A520nm为纵坐标，绘制出标准曲线。

表3 DNS法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制

样品（ml） 1mg/ml葡萄糖 蒸馏水

blank 0 0.50

1 0.05 0.45

2 0.10 0.40

3 0.15 0.35

4 0.20 0.30

5 0.25 0.25

6 0.30 0.20

7 0.35 0.15

8 0.40 0.10

DNS试剂 蒸馏水

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混合均匀，沸水浴中加热5min，取出立即用冷水冷却至室温 4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

将上述各管溶液混匀后，以空白管溶液调T=100%，进行比色测定，测定各管A520nm值。

（2）各级分蔗糖酶活性测定

取5支干净试管，分两组，按表4编号并加入试剂混匀，以空白管溶液调T=100%，读取吸光度值，查标准曲线即可求出葡萄糖的含量。各分级应先稀释一定倍数预做，柱分级Ⅳ用原液，选其吸光度值在标准曲线内为宜）

表4 DNS法测定各分级蔗糖酶活性（N=稀释倍数）

样品 (ml) 0.2M乙酸缓冲液

5%蔗糖 蒸馏水 酶液 DNS试剂

蒸馏水

4.0 1.0

1.0

blank 0.4 0.4 1.2 0

粗酶液Ⅰ(N1)

0.4 0.4 1.0 0.2

粗酶液Ⅱ(N2)

0.4 0.4 1.0 0.2

立即混匀后，40℃保温10min

1.0

1.0 粗酶液Ⅲ(N3)

0.4 0.4 1.0 0.2

沸水浴中加热5min，取出立即用冷水冷却至室温

4.0

4.0

4.0

混匀上述各管，测量各管A520nm值。 3. 各分级蛋白质浓度及酵母蔗糖酶活性的测定

蔗糖酶活力单位（U）：在40℃、pH5.0条件下，以1min内水解产生1μmol还原糖所需酶量为1个活力单位。

蔗糖酶比活力：每mg蛋白质所具有酶活力单位数，一般用酶活力单位U/mg蛋白质表示。

酶的比活力：在酶学研究中用来衡量酶的纯度。对同一种酶来说，比活力越大，没得纯度就越高。利用比活力的大小可比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶纯度高低的一个重要指标。

（五）实验结果与分析

记录实验结果，计算出各步数据填入下表5中。

各分级样液

体积(ml)

总蛋白(mg)

活力(U)

比活力(U/mg)

粗酶液I 粗酶液II 粗酶液III 1ml VII 1ml U1 =C I×N1 /(0.2ml×10min)

P2=C2×N2 /0.2ml ×1ml U2 =C II×NII/(0.2ml×10min) P3=C3×N3 /0.2ml ×1ml U3 =CIII×NIII/(0.2ml×10min)

P1=C1×N1 /0.2ml ×1ml = U1/ P1 = U2/ P2 = U3/ P3

注：C1 ~ C3: 表示蛋白浓度；N1~N3: 表示稀释倍数； C I ~ CIII: 表示还原糖浓度；

P1~P3：表示各分级酶液总蛋白量；U1~ U3：表示各分级酶活力