生物分析技术期末考试609

第二．色谱-福利叶变换红外光谱联用（FTIR） 一．GC-FTIR

1.红外光谱原理：

红外光谱根据不同的波数范围分为三个区： 近红外区 13,330~4000 cm-1（0.75~2.5 μm） 中红外区4000~650 cm-1（2.5~15.4 μm） 远红外区 650~10 cm-1（15~1000 μm）

分子沿重心轴转动的能量为转动能；二个以上原子连接在一起，它们之间的键如同弹簧一样振动，所需能量为振动能。 当分子受到红外光的辐射，如果分子中某个基团的振动频率和它一样，二者就会产生共振，此时光的能量通过分子偶极距的变化而传递给分子，这个基团就吸收一定频率的红外光，产生振动跃迁，形成红外吸收光谱。 2.GC-FTIR概述

质谱一般难于区分同分异构体，单凭MS确定有机物结构有时很困难，甚至不可能。 实现GC-IR的困难 除了工作气压匹配之外，其余工作条件的差异很大。尤其是散射型红外光谱仪，扫描速度和灵敏度远远低于色谱。 FTIR的出现大大促进了GC-IR的发展。FTIR具有光通量大、信噪比好、扫描速度快等优点，与GC的匹配性大大提高。 3.GC-FTIR系统接口装置： 光管: GC/FTIS的关键部件。 ?用硼硅玻璃制成；

?两端装有KBr盐窗，红外干涉光可以通过；

?内壁镀金，有高的反射率，红外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高灵敏度； ?可加热，保证GC流出物不在此冷凝、聚集； ?适当的容积，以获得最佳分辨率和灵敏度。 细内径短光管 有助提高分辨率

长光管 有助提高灵敏度 4． GC-FTIR提供的信息：

（1）三维实时显示红外光谱图 （2）化学图 (官能团色谱图 )

?指定官能团频率范围对时间所作的图；

?是一个“色谱图”，每个峰代表一个组分；

?包含的信息比一般的色谱图多，体现了化合物类型或所含的官能团；

?与GC-MS中的质量色谱图作用相似。

（3）红外重建色谱图

GC-FTIR采集的数据经计算机处理后得到的红外吸收信号对时间所作的图。 ①积分吸收重建图(红外总吸光度重建图 TIA)，相当于GC-MS中的总离子流图(TIC)。不能实时检查。

②Gram-Schmidt重建色谱图 扣除了载气背景的积分重建图。 二.LC-FTIR

1.LC/FTIR接口——流通池接口 工作原理：

首先经液相色谱分离的馏分随流动相顺序进入流通池，同时FTIR同步跟踪，依次对流通池进

行红外检测，然后对获得的流动相与分析物的叠加谱图作差谱处理，以扣除流动相的干扰，获得分析物的红外光谱图，进而通过红外数据库进行计算机检索，对分析物进行快速鉴定。 特点：

装置简单、操作方便。 局限性：

a)流动相的干扰难以彻底消除；b)不适合梯度淋洗技术；c)被测物在池内受检时间受色谱峰出峰时间限制而无法 采用信号平均技术提高红外谱图的信噪比等。 因此，流动池法的应用受到了限制，最理想的办法是在测定光谱前去除流动相。

2.LC/FTIR接口——流动相去除接口

流动相去除接口是在测定红外光谱之前将通过物理或化学方法将流动相除去以排除溶剂的干扰。目前已报道的该类接口有许多种，最具有实际意义的有雾化接口、漫反射转盘接口等。 正相色谱：

（1）漫反射转盘接口 工作原理：

由色谱柱出来的流出物首先经过一个加热管，使90%的流动相挥发除去，浓缩的样品滴入装有细KBr或KCl粉末的样杯，若干个样杯装在一个转盘上，由微机控制其转动。特点：灵敏度高， 但只适用于分析沸点高且有UV吸收的物质。因水难去除，仅适用于正相色谱。 （2）连续雾化接口 工作原理：

色谱流出物流入雾化器被直接喷雾在装有金属轴的NaCl晶体窗片上，然后溶剂立即被蒸发除去，而溶质则以微粒结晶析出。然后以FTIR检测窗片上的流出物。特点： 常温下分离溶剂，适用于不易挥发而易热分解的有机化合物。 反相色谱：

（1）连续萃取式漫反射转盘接口 工作原理：

首先将含水流动相与萃取剂二氯甲烷混合，经萃取管后，流出物分为水相和有机相，密度小的水相被吸气瓶吸去，有机相部分被导入样品浓缩器，进而滴入漫反射转盘上的样品杯。特点：常温下分离溶剂，适用于不易挥发而易热分解的有机化合物。 （2）热雾化接口 工作原理：

由HPLC出来的流出物被加热雾化在光管内壁上，用多次反射光谱法测定光管壁上附着的溶质。此装置有四个一样的光管，依此收集、测量、清洗和干燥。如此反复。 特点：能有效除去溶剂，但灵敏度不高。 3.LC/FTIR两种接口比较 流动相去除法的缺点：

与流动池法相比，流动相去除法的接口装置复杂，且操作需一定经验。 流动相去除法的优点：

1. 无流动相干扰，可使用多种流动相；

2. 适用于梯度淋洗，提高了样品的分离检测能力；

3. 当进行离线红外检测时，可使用信号平均技术，增加谱图的信噪比，检出限一般较流动池接口低。

第三.色谱-原子光谱联用

一.GC与原子光谱联用技术

1为什么将GC和原子光谱联用？

① 金属元素存在不同的形态和价态，其毒性相差较大。

② 利用色谱将不同价态和形态的微量元素进行分离，然后再用原子光谱进行测定。 2联用“接口”的作用

色谱与原子光谱的“接口”就是要在不降低色谱分离性能的前提下将色谱分离后的组分尽可能多的送入到原子光谱的原子化器中使之原子化，同时不降低原子化器的原子化效率。 基态：在无外来作用时，原子中各电子都尽可能处于最低 能级，从而使整个原子的能量最低，原子的这种状 态称为基态。

激发态：当原子受到外来作用时，它的一个或几个电子吸 收能量后跃迁到较高能级，从而使原子处于能量 较高的新状态，此状态称作激发态。 激发：原子由基态跃迁到激发态的过程叫做激发。

退激：激发态是一种寿命极短的不稳定状态，原子随即 跃迁回基态，这一过程叫做退激。 原子发射光谱： 原子从某一激发态跃迁回基态，发射出具有一定波长的一条光线，而从其它可能的激发态跃迁回基态以及某些激发态之间的跃迁都可发射出波长不同的光线，这些光线形成一个系列（谱），称为原子发射光谱，简称原子光谱。

原子吸收光谱： 将一束白光通过某一物质，若该物质中的原子吸收其中某些波长的光而发生跃迁，则白光通过物质后将出现一系列暗线，如此产生的光谱称为原子吸收光谱。 等离子体（Plasma）在近代物理学中，是指一种在一定程度上被电离的气体，其中电子和阳离子的浓度处于平衡状态，宏观上呈电中性的物质。

电感耦合等离子体ICP：是由高频电流经感应线圈产生高频电磁场，使工作气体形成等离子体，并呈现等离子体焰炬，达到10000K的高温，是一个具有良好的蒸发-原子化-激发-电离性能的光谱光源.

二. LC与原子光谱 联用技术

LC-FAAS液相-火焰原子吸收光谱最简单的联接方法是用一根低扩散蛇形管作为接口 三.色谱-核磁共振波谱联用

1.色谱-核磁共振波谱联用普及的原因

①核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段 ，由于其可深入物质内部而不破坏样品 ，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用 ，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科 ，在科研和生产中发挥了巨大作用 。

②高效液相色谱是分析复杂有机物、药物和生物大分子等混合物的一种重要手段，但紫外、荧光、电化学等检测器只能得到非常有限的分子结构信息。 ③NMR能够提供大量的分子结构信息，但NMR分析方法要求样品为纯品，对于复杂的混合物，因为NMR信号的互相覆盖，单纯靠NMR谱则显得无能为力。

④在核磁仪器前加上一级色谱分离设备把直接样品分离后再送人NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度，这就是色谱分离技术与NMR波谱仪结合并且日趋普及的原因。

2.HPLC-NMR联用装置

典型的HPLC-NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成LC系统，通过一条2～2 .5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。可以将NMR 视为HPLC 的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。

3.NMR探头是联用装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。 HPLC-NMR探头由一个不旋转的直接固定在射频线圈上的玻璃管构成，它处于传统探头玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管内径为2，3或4 mm。玻璃壁长度至少超过质子检测线圈(18 mm)，并与之平行，同时向两端逐渐变细。 4.运行模式

（1）在流运行模式

在流运行模式是将HPLC的输出直接连接到1H NMR的检测池，连续检测HPLC的洗脱液。 1H NMR成为HPLC的检测器。

（2）直接停留模式：（停留运行模式 ）

通过UV检测器确定了色谱峰位置之后，准确得知欲测组分到达 1H NMR检测池的时间。一旦欲测组分到达检测池，立即将HPLC泵停止，使色谱峰准确地停留在NMR检测池中进行检测。 主要缺点是：由于色谱流动相阶段性停止，大大增加了分离时间，从而可能会使色谱峰展宽，分辨率下降。

（3）环存储运行模式： （停留运行模式）

在色谱分离的过程中，将各个色谱峰的一部分转移到不同毛细管中．然后再分别进人NMR检测池进行扫描分析。在整个过程中，色谱峰并没有任何停顿，所以就解决了直接停留模式所带来的色谱峰展宽问题。

生物色谱技术

1生物色谱法（Biochromatography）是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。 适用条件：亲和色谱—固定相和研究对象都是生物大分子 细胞膜色谱—固定相含有生物大分子 常规色谱—研究对象是生物大分子

2细胞膜色谱Cell Membrane Chromatography, CMC将细胞膜结合到硅胶表面，制成细胞膜固定相，利用色谱学技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法 特点：分离 + 活性筛选 合二为一 化学成分-----效应-----作用机理

适合于天然药物活性成分的筛选及药物作用机理的研究。 3亲和色谱Affinity Chromatography，AC利用生物大分子具有对某一类生物大分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。 亲和体系 ： 特异性 高特异性 亲和体系 抗原－抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质－肝素 酶、蛋白质－活性色素（染料） 酶、蛋白质－过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等） 群特异性