生物技术制药重点及名词解释

3、蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法 4、蛋白质等电点的测定 5、蛋白质序列分析

? N末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白质的种类；C末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工

6、蛋白质二硫键分析 7、蛋白质活性的测定 8、免疫测定法

9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析

基因工程药物的实例：干扰素(IFN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF)、人白细胞介素-2(IL-2)、

胰岛素、人生长激素(hGH)

第三章 动物细胞工程制药

动物细胞的体外培养

★ 体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞

? 贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型(主要来源于中胚层组织)；上皮样细胞型(主要来源于外胚层和内胚层组织)

? 非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞 ? 兼性贴壁细胞：如CHO细胞、小鼠L929细胞

动物细胞的生理特点

1) 细胞的分裂周期长，一般为12~48h(G1 → S→ G2→ M) 2) 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 3) 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的

4) 动物细胞对周围环境十分敏感(如渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱) 5) 动物细胞对培养基的要求高(需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。) 6) 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 培养条件要求高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰

★ 动物细胞培养的条件

(一)环境条件： 直接接触的器材、防止污染(显著地污染标志：pH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现细胞集落)、水质、pH(大多是7.2-7.4)、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质 (二)营养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等

? 碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖

? 氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸

? 在多数情况下，需要添加5％－20％的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。

培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基

? 天然培养基：主要见于早期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清(最常用有效)、羊水、腹水等。分维持液(低或不含牛血清)和生长液(5%-20%牛血清) ? 合成培养基：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等 ? 无血清培养基

①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响； ②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险； ③供应充足、稳定； ④细胞产品容易纯化；

⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；

⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析

血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋

白，必须的脂肪酸和微量元素

★ 其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基pH调整液；细胞消化液(胰蛋白酶，EDTA)；抗生素溶液

动物细胞培养的基本技术和方法 ★ ★ 动物细胞培养的方法：原代培养、传代培养、克隆培养

? 细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块→剪碎→分散处理(加胰蛋白酶或胶原蛋白和EDTA)→洗涤纯化→计数稀释→培养

? 细胞的传代培养：离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中 ? 单克隆培养

动物细胞培养的基本技术：细胞分离(离心法；蛋白酶消化法)；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存(慢冻，液

氮,－196度) 和复苏(快融，投入37℃水浴融化)

? 冻存主要步骤：活性好的细胞，加保护剂(DMSO等)混合；做好标记(细胞种类、日期等)；逐渐降低温度，最后放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻

生产用动物细胞

? 原代细胞：费钱费力，少用

? 传代细胞系：安全，特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50代)

? 转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培

养

? 工程细胞系：融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法)；基因工程细胞系

? 病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统 ? 基因工程细胞主要的筛选系统，

①HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞 ②GPT(HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)选择系统，筛选gpt+的转化细胞 ③G418(Geneticin)选择系统，筛选Neor的转化细胞 ④MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞

细胞库的建立：原始细胞库(MCR)→生产用细胞库(MWCR，又称工作细胞库，主细胞库→生产细胞库) 常用生产用动物细胞：BHK-21，C127细胞，CHO-K1，COS细胞，MDCK细胞，WI-38，MRC-5，Namalwa，

Sf-9，Vero，SP2/0-Ag14

动物细胞大规模培养

★ 动物细胞的大规模培养方法

? 悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞

优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。

缺点：细胞培养密度较低。

? 微载体培养：用于培养贴壁细胞。充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、

无毒性、表面惰性、比重适当(1.030~ 1.045g/ml)、粒径均一，在60~250?m之间(溶胀后)、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分

? 多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内，能避免受到剪切力的损伤，因此培养体

系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件：具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性

? 微囊化培养：避免剪切力对细胞造成的损伤；获得较高细胞密度107－108个/ml；利于纯化；可采用多

种生物反应器进行培养

? 中空纤维培养：把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。

理想的动物生物反应器必须具备的基本要求：

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧

体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。

生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。 密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。

培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。 可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言。 容器加工制造时要求内面光滑，无死角。

拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。 设备成本尽可能低。

★ 动物细胞生物反应器

? 规模：实验室规模：<20L；中试规模：20－100L；生产规模：>100L

? 类型：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养 ? 主要操作方式：

? 分批式操作：能够控制的参数只有PH、温度和通气量 ? 补料-分批(或流加式)操作：不断地向系统中补充新的营养成分 ? 半连续式操作

? 连续式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。

转基因动物 基本原理及步骤：外源目的基因的制备→外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞→选择获得携有目的基

因的细胞→选择合适的体外培养系统和宿主动物→转基因细胞胚胎发育及鉴定→筛选所得的转基因动物品系

转基因动物制作方法

? 经典的技术路线 ：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低

? 整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率 ? 核移植(克隆)的技术路线：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。

? 整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。

? 具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法 ★

转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因表

达水平低

转基因动物反应器：(bioreactor)目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。如乳腺、膀胱、血液等

动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶

原、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗

第四章 抗体工程制药

概述

抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体攻击 病变細胞；检验，以 ELISA侦测特定病原体；

多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)简称多抗。如:免疫血清(含多种特异性抗体)

实际意义：预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清(抗破伤风)；胎盘球蛋白(抗病毒感染)。副作用：?超敏反应。 临床诊断，如：肥达氏反应(伤寒、副伤寒)。缺点：特异性差

单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb )简称单抗 ★

优势：特异性高：只识别某一个特定的抗原决定簇。 均一性好：其H链、L链及V区独特性其完全一致，

所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。

杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能无限增殖

抗体分子的结构和功能 ★ ? 基本结构: 四肽链结构

? 重链(H链)和轻链(L链)天然Ig分子中，重链同类，轻链同型。

重链可分为五类：μ、γ、α、δ、ε链——IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；轻链可分为κ、λ型。

? 可变区(V区)、恒定区(C区)和铰链区(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)

? VL 、VH区各有3个超变区(也称互补决定区，CDR1-3)，共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR) ? C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。

? 抗体分子的价位：指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2价分子。

单克隆抗体的制备

产生杂交瘤细胞的三个关键点：B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选 单克隆抗体制备的基本过程(理解)：抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的B淋巴细胞，B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤

细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体,最后进行纯化。

? 抗原和免疫：抗原的制备(通常和佐剂混合，增强免疫应答)、免疫动物(体内/体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)

? 细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选

? 细胞的融合：制备脾细胞悬液：最后一次免疫后三天，1×108个； 制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期

细胞，(2～3)×107个； 融合：40－50％PEG(MW4000)，37℃，5min

? ★ HAT培养基筛选杂交瘤细胞

HAT培养基筛选原理：H(次黄嘌呤)；A(氨基蝶呤)；T(胸腺嘧啶)。骨髓瘤细胞不具备HGPRT和 TK，

B淋巴细胞寿命短。 影响细胞DNA的合成：H促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)途径； T促进了胸腺嘧啶激酶(TK)途径；内源性途径(谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸，二氢叶酸还原酶途径)被A(叶酸的拮抗物)阻断

步骤：融合后细胞→HAT培养基→HT培养基→正常培养基 ? 杂交瘤细胞的检测和克隆

抗体的检测：仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射

免疫测定法、流式细胞仪法

杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。经过3－4轮克隆化，才能达到100％孔内均为阳性

细胞克隆。耗时长(3－4月)

? 杂交瘤细胞的冻存：冻存原始细胞

? 单克隆抗体的大量制备：体内接种法(皮下接种、腹腔接种)；体外培养法

? 单克隆抗体的鉴定和检测

? 单克隆抗体的检测

? McAb特异性检测：检测有无抗原抗体结合；检测有无交叉反应。ELISA、间接免疫荧光法 ? McAb类和亚类的鉴定：类的鉴定一般在杂交瘤的克隆化过程中可以确定(兔抗鼠IgG或IgM作为二抗用于ELISA)亚类的确定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心ELISA。 ? 其他鉴定：中和活性鉴定；识别抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价(滴度鉴定)；纯度鉴定 ? 杂交瘤细胞的鉴定：主要是对杂交瘤细胞进行染色体分析

抗体治疗疾病的机制：中和作用、导向作用、拮抗作用、ADCC、CD、Aonist 抗体在疾病治疗中的应用

? 作为诊断试剂：病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细胞因子的测定

? 作为治疗药物：抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病

制约抗体药物迅速发展的主要障碍：免疫原性；分子量大