花叶冷水花快繁术研究 - 图文

中南林业科技大学本科毕业论文 花叶冷水花快繁技术研究

4.讨论

4.1关于外植体污染的控制

4.1.1褐化及控制措施

褐化，也称酚污染，是指外植体在组织培养过程中，自身组织中酚类化合物 与空气接触发生氧化反应产生棕褐色的酮类物质，使外植体变褐并逐渐死亡的现象。褐化中产生的有毒物质不仅使外植体和培养基变色，而且抑制很多酶的活性，严重影响外植体愈伤组织的诱导和脱分化，甚至会造成其死亡。褐化现象的发生与否是由外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性决定的。因此，影响褐化的因素主要为外植体材料和酶促因子[30]。有研究表明，抗氧化剂聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及抗坏血酸(Vc)浓度为200mg/ L时，可延迟野牛草(Buchloe dactyloides)成熟胚愈伤组织的褐化；缩短继代周期至5d可有效防止愈伤组织褐化；外源多胺能影响内源多胺与乙烯的合成，并可减轻愈伤组织的褐化，改善其质量[31]。无花果((Ficus carica)组织培养中，刚长出幼叶的顶芽与未发芽的顶芽相比，褐化现象较严重，分化率也较低[32]。王文静等[33]在莺尾(Iris tectorum)组织培养的培养基中加入0.10% Vc或0. 3%活性炭能明显防止褐化。刘闻川等[34]探讨了黑暗和1 000,2 000 , 3 000 lx的不同光照条件对槲蕨(Drynaria roosii)组织培养外植体褐化的影响，结果表明，在1 000 lx光照处理下槲蕨外植体的总酚含量积累较少。

在组织培养中可采用以下方法来避免或减轻褐化：1)培养基中加入抗氧化剂(如Vc、柠檬酸、二硫苏糖醇等)或在抗氧化液中对外植体进行切割、剥离等处理。2)经常继代可以防止酮类物质在培养基中的积累，减轻其对外植体的伤害，降低褐化发生的概率。3)培养基中加入1%的活性炭，由于其吸附作用可以除去酚类氧化产物，减少有毒物质对外植体的毒害；活性炭还可以减少光照强度，进一步降低褐化发生的可能；但活性炭也会吸附培养基中的营养物质和外源激素，所以含量不能过多。4)光照可以诱导植物组织内有些酚类氧化酶的活性，因此，组织培养的最初阶段在黑暗条件下进行会减少褐化的发生。

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4.1.2污染及解决措施

植物组织培养的过程较长，培养基中营养物质充足，光照、温度、湿度和pH值等培养条件也适合大多数微生物的生长，并且微生物生长迅速、繁殖周期短，所以组织培养中任何一步带菌都会污染整个体系。一般造成污染的原因有两种：1)外植体本身寄生了很多微生物；2)实验环境和操作过程中病原侵入到培养基中而造成污染。引起污染的微生物主要有细菌、霉菌和酵母菌三类，后两类生长较快、造成的污染很容易发现并及时处理；但是细菌在培养基中有潜伏期，造成的污染一般不容易觉察，因此，细菌造成的污染在植物组织培养中是最严重的。污染不仅影响外植体的正常生长，更破坏了组织培养的正常进行，造成时间和资源的浪费。因此，在植物组织培养过程中，应该严格控制污染：对外植体进行严格的消毒，一般在75%的酒精、5%的次氯酸钠或1%的升汞溶液中漂洗，在不损害外植体生长活力的情况下将其自带的病原降到最少[35]；保持操作环境的清洁，操作中应穿戴橡胶手套、口罩、帽子，减少甚至消除环境和操作过程中的污染。

4.1.3玻璃化现象及其消除办法

玻璃化(vitrification)也称过度水化现象，是指植物组织培养过程中外植体因生理失调或生理病变而呈半透明状、外观形态异常的现象。由于玻璃化苗的生理功能异常，难以移栽成活，玻璃化苗的出现对植物快速微繁殖是不利的。在木本及草本植物中已报道出现玻璃化苗的植物达70多种[36]。玻璃化苗的组织或植株呈半透明、水渍状，脆弱易碎[37]；叶绿素和蛋白质含量显著下降，分化能力降低，很难继续增殖和生根[38]。目前，研究已证实玻璃化现象只是植株的一种表型特征，玻璃化的组织器官在一定条件下可恢复，并不会遗传到后代[39]。

防止玻璃化的方法主要有:1)基本培养基选择固体培养基，并适当提高培养基中琼脂的浓度，降低培养基的衬质势，阻止细胞过多的吸水，从而防止玻璃化现象的发生；2)增加培养基中蔗糖的含量，培养基的渗透势也就会随之降低，外植体不能从培养基中获得过多的水分而发生玻璃化现象；3)降低培养基中细胞分裂素的浓度；4)严格控制温度；5)把外植体置于自然光照下培养，可消除轻微的玻璃化现象；6)尽可能的增加培养容器的通风性，以降低相对湿度，改善氧气供应

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状况，可选用透气性好的封口膜封口。张燕玲等[40]在满天星(Gypsophila sp.)组织培养中，发现玻璃化苗的数量随着培养基中糖分和琼脂浓度的增加而减少，而且聚乙烯醇对满天星玻璃化现象有明显的抑制作用。赵佐敏[41]在非洲菊(Gerbera jamesonii)组培苗玻璃化控制研究中表明，随着6-BA浓度的降低，玻璃化苗比例呈递减趋势；随着温度的降低（从28℃降到18℃），玻璃化苗逐渐消失；使用透气性封口膜可抑制玻璃化苗的产生。

4.2采取部位及采样季节对花叶冷水花外植体不定芽分化的影响

不同的取材部位，植株的全能型和激素的含量不同，在取材时应很好的选择，以最大可能的增加植株诱导的发生。一般情况下，分化能力较好。试验中发现嫩叶作为采样部位，能最大化的诱导外植体的分化成苗。

春季多阴雨天气，空气湿度大，细菌滋生。冬季多晴朗天气、气温不高且空气湿度较低，比较适合外植体取材。从试验中明显看出冬季节外植体污染率要略低于春两季。但外植体分化率在春季远高于冬季。综合比较，春季较适合外植体的取材。

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参 考 文 献

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