哺乳动物DNA聚合酶Pol δ

修复蛋白以及各种信号通路调节蛋白共同参与DNA损伤修复的呢？对于这一机制人们还不是很清楚。当DNA损伤无法修复时，细胞自身将激活一系列受体/线粒体凋亡途径，使细胞进入到凋亡途径，来去除损伤的细胞，避免突变和癌症的发生。已有研究表明Pol δ参与细胞凋亡过程，p12亚基在凋亡早期首先被酶解，在中期又发生回复，而在凋亡晚期再次被酶解，具有明显的时相性。那P12又是如何与其它参与细胞凋亡的蛋白相互作用的呢？

本研究以HeLa细胞和黑素瘤细胞为材料，研究在细胞损伤和凋亡过程中，Pol δ是如何与其它复制蛋白、修复蛋白以及各种信号通路调节蛋白相互协调作用的。这些研究有助于寻找到潜在的与DNA损伤修复有关蛋白及进一步从分子水平阐明DNA损伤修复的机制，探索Pol δ除了在DNA复制和损伤修复过程中的重要功能外，在细胞凋亡过程中扮演的未知新功能。

第二章

各种细胞外在因素和内在因素都能导致DNA的损伤，破坏了基因组的完整性，从而产生许多的突变导致许多疾病的发生，例如，癌症。当DNA受到损伤，细胞内各种传感器相互作用，产生各种信号，触发DDR募集和装备一系列与修复相关的蛋白复合物来进行DNA的修复。针对前期的研究发现，p12亚基在发生损伤过程中发生下调现象，本章研究主要验证此此现象，并针对p12的下调，分析其它参与DNA损伤响应蛋白的调控变化。

2.1 材料与试剂

人宫颈癌HeLa细胞（HeLa-S3）、黑色素瘤细胞作为体内实验的研究对象。用损伤试剂/诱导试剂处理的HeLa、黑素瘤细胞作为实验组，未处理的HeLa、黑素瘤细胞作为对照组[79]。 主要试剂

细胞培养相关试剂：DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，

Gibco-BRL)；胎牛血清FBS( Gibco-BRL)；双抗(Penicillin-Streptomycin Solution，Gibco-BRL)；胰蛋白酶

（Gibco-BRL）[79]；

细胞损伤处理试剂：HU（Sigma）；aphidicolin (APH，Sigma）；methanesulfonate

(MMS，Sigma)； MG132 (Beyotime)；

2.2.1 细胞培养相关试剂

细胞培养基：量取胎牛血清（FBS）50 mL，双抗5 mL，用DMEM培养基定容到500 mL（10% FBS,1% 双抗）。

胎牛血清（FBS）：新到的胎牛血清要在56℃下灭活1h，然后分装，-70 ℃冰箱冷冻保存。

1×磷酸缓冲液（phosphate belanced solution, PBS）(1 L)：称取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.24 g，Na2HPO4 1.44 g溶解于800 mL ddH2O中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加ddH2O定容至1 L，高压蒸汽灭菌20 min，室温保存；

细胞冻存液：量取胎牛血清（FBS）1 mL，DMSO 1 mL，用DMEM培养基定容到10Ml(1% FBS,1% DMSO)。 2.2.2 损伤处理相关试剂配制

HU储存液（1M）：将0.76g HU固体粉末溶于10mL无菌水中，用0.22um的膜过滤平均分装成10小管，放入-20 ℃冰箱中冷冻保存。

MMS储存液（0.5M）：量取420uL的MMS纯溶液，加入到10 mL DMSO溶液中，用0.22 um的膜过滤后，平均分装成10小管，放入-20 ℃冰箱中冷冻保存。

Aphidicolin储存液（150uM）：将1mg的Aph固体粉末溶于19.7mL的DMSO溶液中，用0.22um的膜过滤后，平均分装成10小管，放入-20 ℃冰箱中冷冻保存。 2.2.3 Western Blot相关试剂配制

SDS-PAGE Running Buffer（10×）：称取甘氨酸144 g，Tris碱30.3 g，SDS粉末10 g，ddH2O定容至1 L；

SDS-PAGE Running Buffer（1×）：量取10×母液50mL，ddH2O定容至500mL； 转膜缓冲液Transfer (10×)：称取Tris碱30.3g，甘氨酸144g，ddH2O定容至1 L；

转膜缓冲液Transfer (1×)：量取10×母液50mL，甲醇100mL，ddH2O定容至500mL；

TBS缓冲液(10×)：称取NaCl 87.7g，Tris碱12.1g，用HCl调pH至7.5-8.0，ddH2O定容至1L；

TBST缓冲液（1×）：量取10×TBS缓冲液100mL，吐温（-20）1mL，震荡，ddH2O定容至1 L；

丽春红染色液：称0.5g丽春红固体，溶于25mL乙酸中，震荡至其溶解，加 ddH2O定容至500mL；

5%的牛奶封闭液：称取1 g脱脂奶粉溶于20 mL TBST（1×）溶液中； 碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）显色液：用移液枪吸取1 mL AP反应溶液，加入6.6 μL NBT（150×）溶液和3.4 μL BCIP（300×）溶液，混匀。

蛋白上样缓冲液（5×）：量取1 mol/L Tirs-HCl (pH8.8) 0.6 ml，10% SDS 2 ml，50%甘油5 ml，2-巯基乙醇0.5 ml ，1%溴酚兰1 ml ，加ddH2O定容到10 ml；

蛋白上样缓冲液（1×）：量取5×蛋白上样缓冲液250 ml，加1×PBS定容至1 L； 过硫酸铵APS(10%)；称取0.1g过硫酸铵粉末，溶于1mLddH2O中，震荡混匀，4 ℃冰箱中保存；

不同浓度SDS-PAGE GEL配制 分离胶（下层胶）配制 浓 度 剂 试 12.5% SDS-PAGE GEL（2块胶） 5.515ml 4.25ml 170μl 7.1ml 85μl 11μl 17ml 12% SDS-PAGE GEL（2块胶） 5.78ml 4.25ml 170μl 6.9ml 85μl 11μl 17ml ddH2O 1.5M Tris-Hcl 8.8 10% SDS 30% Acrylamide 10% AP TEMED Total 浓缩胶（上层胶）配制 试剂 2块胶

ddH2O 1.5M Tris-Hcl 8.8 10% SDS 30% Acrylamide 10% AP TEMED Total

2.2.4 细胞裂解液的配制 HeLa 细胞裂解缓冲液 (50ml) 试剂 Tris-HCl(pH 7.8) EGTA EDTA MgCl2 Glycerol NP-40 NaCl 储存浓度 1M 0.5M 0.5M 1M 100% 100% 5M 2.4ml 1ml 40μl 0.536ml 20μl 4μl 4ml 终浓度 50mM 0.5mM 1mM 1mM 10% 0.5% 200 mM 所需体积 2.5ml 50μl 100μl 50μl 5ml 250μl 2ml *使用裂解液时提前加入PMSF（终浓度：1 mM） 黑素瘤细胞裂解缓冲液 (50ml) 试剂 Tris-HCl(pH 7.8) EGTA EDTA MgCl2 Glycerol NP-40 NaCl

储存浓度 1M 0.5M 0.5M 1M 100% 100% 5M 终浓度 50mM 0.5mM 1mM 1mM 10% 0.5% 200 mM 所需体积 2.5ml 50μl 100μl 50μl 5ml 250μl 2ml