哺乳动物DNA聚合酶Pol δ

摘 要

哺乳动物DNA聚合酶Pol δ，是一个由四亚基组成的复合物，四个亚基分别是p125、p50、p68和p12。它不但在真核生物DNA复制过程中起着重要的作用，而且也参与DNA的修复和基因重组。在维持细胞周期的正常调节以保证基因组结构的完整性和遗传的稳定性等方面具有特殊的重要意义。

DNA在细胞内外各种因素的作用下可产生严重的损伤，破坏了基因组的完整性。为了应对复制压力或基因损伤试剂造成的DNA损伤，细胞自身拥有一套防御机制─DNA损伤应答（DDR）。这一机制通过募集和装备一系列与修复相关的蛋白复合物来协调整个应答网络系统，包括DNA修复、细胞周期检查点的激活以及细胞的凋亡等。目前普遍认为DDR是一个复杂的过程，它能够使DNA进行修复，固定损伤突变的位置或者通过细胞的死亡来消除损伤。就像Derks等提到的，传感蛋白检测到DNA损伤，并将一系列的相关因子招募到损伤点。例如，修复因子等。相应的，这些感受器扩大对效应器的损伤信号，如p53和微小RNA，它们能够控制细胞多种通路的活性，如细胞周期的停滞和凋亡。传感器和DDR信号的转导主要依赖于蛋白质和蛋白质的相互作用以及蛋白质翻译后的修饰。转录组学、全基因组RNA转录表达水平和蛋白质组学的研究极大地扩展了我们对DDR的认识。研究表明，有许多其它的蛋白是检查点激酶的靶标，在转录因子/微RNA的调控下，1000多个基因在DNA损伤处差异表达。因此，DDR的严格监控是非常重要的。

在DNA损伤中，DNA聚合酶Pol δ的P12亚基发生降解，使Pol δ4四聚体转换为三聚体Polδ3以应对DNA损伤。当损伤无法修复时，细胞凋亡或衰老程序将被激活，来去除损伤的细胞，避免突变和癌症的发生。细胞凋亡作为细胞一种基本的生命活动现象，不但在生物体内去除衰老和异常的细胞中起着重要的作用，而且它在内环境的稳定、生物体的进化以及多个系统的发育中也有十分重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的生物学机制和重要的生物学意义。细胞凋亡是一个多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、癌基因C-myc等，尽管分子生物学技术的发展对细胞凋亡的过程有了更加深入的认识，但是到目前

为止对凋亡过程确切机制仍不完全清楚。一旦凋亡过程发生紊乱，可能会直接或间接的导致多种疾病的产生。如自身免疫性疾病、肿瘤等。

本研究可以加深我们对细胞如何应对DNA损伤的理解，对揭示人类癌症的病因或由于基因的不稳定导致的其它疾病具有重要的意义。同时，本研究也为今后以 Pol δ为潜在新靶标，设计新的肿瘤诊断、治疗手段来抗击癌症疾病提供理

1.1 真核生物DNA聚合酶δ的介绍

DNA聚合酶δ(Pol δ)是被发现的第一个具有3’-5’核酸外切酶活性的真核细胞DNA聚合酶。在这之前，人们认为只有原核生物或噬菌体才具有校对功能的酶[1]。Pol δ不但具有5’-3’聚合酶的催化活性，还有3’-5’核酸外切酶的活性，这种特有的框架阅读校正功能使得Pol δ作为一种高度保真的聚合酶，在维持正常的细胞周期、保证基因组结构的完整性以及遗传稳定性等方面有着重要的作用。

早期人们通过研究来自小牛胸腺[2-4]和人胎盘[5, 6]的聚合酶δ，认为Pol δ是由p125和p50亚基组成的异源二聚体。当时人们认为DNA聚合酶δ就是具有3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶α[7]。后来这种说法被证明是错的，因为聚合酶催化活性和核酸外切酶活性与p125的催化亚基有关。随后，Lee MY 博士和 Hughes P 博士实验室相继发现了第三亚基 p68，和p12小亚基。现在发现了“Pol δ”的第二种形式-Pol ε，[8-10]它有一个更大的催化亚基。p125亚基的分子克隆表明，从T4噬菌体到人类的进化过程中，它的催化核心是高度保守的[11-13]。现在Pol δ归为DNA聚合酶B家族的成员。

现在大部分的焦点转移到了酵母聚合酶δ的研究上，包括它的性质以及它在DNA复制和修复中的作用[14]。这为生物化学和遗传学的研究，特别是对酿酒酵母酶的研究，提供了许多的见解。酿酒酵母的聚合酶δ是一个由p125、p50(Pol3 and Pol31)和pol32亚基组成的异源三聚体[15]。为了区分酿酒酵母和与它相似的粟酒裂殖酵母，酿酒酵母的聚合酶δ被称为y Pol δ3。粟酒裂殖酵母含有第四个亚基Cdm1[16]，被称为y Pol δ4。尽管pol32的缺失会导致DNA复制和修复的缺陷，但是它在酵母细胞中是不必要的[14]。然而，粟酒裂殖酵母细胞中如果没有Cdc27将无法存活[7]。Cdm1亚基对于粟酒裂殖酵母细胞的生长和分裂也是没有必要的[17]。通过鉴定与pol32亚基同源的p68和p12亚基, 哺乳动物Pol δ被证

明是一个四亚基聚合酶。人类的 Pol δ4与裂殖酵母的ypolδ4一样，也是一个四聚体，由p125、p50、p68和p12四个亚基组成。人类p125的催化核心与酵母和裂殖酵母的聚合酶δ的同源性高于60%，这说明进化强大的保守性。然而，人类的p68和p12与酵母的相比相似性较小。 1.1.1 真核生物DNA聚合酶δ的结构

真核生物DNA聚合酶δ被认为是高度保守的DNA聚合酶。长期以来一直认为Polδ是一个只由催化亚基p125与p50亚基组成的异源二聚体。真核生物DNA聚合酶δ的亚基组成存在一定的差异，后来发现哺乳动物细胞DNA聚合酶δ是一个由p125、p50、p68和p12组成的异源四聚体，其中p125为催化亚基，p50为小亚基，p68和p12常被称为调节亚基。

p125是哺乳动物DNA聚合酶δ的催化亚基，具有3’-5’聚合酶催化活性和3’-5’核酸外切酶活性。其编码基因POLD1位于第19号染色体的q13．3～13．4上[18, 19]，现在已经从多种生物中分离出能够编码p125的cDNA。它的cDNA全长约为3.5kp，能编码1107个氨基酸残基，计算的分子量约为124 kDa。p125含有6个保守的聚合酶同源序列区，从N-末端开始分别是Ⅳ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅰ和Ⅴ区。Ⅰ区的保守性最高，Ⅳ区的保守性最低。p125亚基的C-末端也是很保守的，除了含有高度保守的CT-1、CT-2和CT-3区域外，还含有两个锌指状结构域：ZnF1和ZnF2，它们只存在于真核细胞B类DNA聚合酶中。它们在蛋白-DNA和蛋白-蛋白的相互作用中有着重要的作用。这些保守区域对Pol δ行使功能十分重要，区域的缺失或变异将会对Pol δ的活性产生巨大的影响。p125的N-末端有增殖细胞核抗原(PCNA)的结合位点-N2区域，Pol δ可以通过其N2区域的一个“PIP”（PCNA-Interacting Protein motif） 与PCNA发生粘连反应。

p50是哺乳动物DNA聚合酶δ的小亚基，也被称为第二亚基。其编码基因POLD2位于第7号染色体上，由469个氨基酸残基组成，计算的分子量约为50.885 kDa。它与催化亚基p125紧密相连组成DNA聚合酶δ的核心酶结构。哺乳动物中p50的保守性与p125的保守性相似，但在酵母中p50的保守性却低于p125的保守性。实验表明哺乳动物中p50的保守性较高。人的p50与鼠的p50同源性和相似性比较高，分别为94%和97%。但是酵母细胞的p50与人的p50同源性和相

似性只有34%和35%。p50在四亚基构成的全酶中占据了一个核心的位置，既能够与催化亚基p125紧紧捆绑，也可以与p68和p12亚基分别结合。因而p50可以作为一个关系纽带和募集平台发挥重要的作用。酵母双杂交实验表明p50是Pol δ结合到PCNA上所必须的[20, 21]。

p68是哺乳动物DNA聚合酶δ的调节亚基，也被称为第三亚基或p66亚基，其编码基因为KIAA0039的互补核糖核酸，p68/ p66亚基由46个氨基酸组成的，计算分子量约为51.4kDa。Hughes等科学家以鼠FM3A细胞作为研究对象，通过甘油密度梯度离心和PCNA亲和层析的方法，从细胞中分离纯化了p66亚基，同时它也第一个被鉴定出来的PCNA绑定蛋白。随后p66被确认为哺乳动物DNA聚合酶δ的第三亚基。p66除了能与PCNA结合外，它可能也能够结合RFC，因此也是DNA聚合酶活性所必须的[22, 23]。在Lee MY博士实验室，科学家们以牛胸腺为研究对象，利用甘油梯度离心、FPLC凝胶过滤层析以及免疫亲和层析等技术，分离纯化出一段分子量大小为68-70KDa的多肽，该多肽与p66的肽序列非常相似，因此将p68也定为DNA聚合酶δ的第三个亚基。p68也是一个PCNA的捆绑蛋白，可以通过磷酸化/去磷酸化的修饰作用，调控DNA聚合酶δ的活性[1]。

p12是哺乳动物DNA聚合酶δ的最小亚基，也称为第四亚基，由107个氨基酸残基组成，计算分子量为12.4 kDa。为了分离出DNA聚合酶δ的其他亚基（除了p125和p50），Liu等采用新的分离纯化方法，得到了高活性的蛋白复合物（包括p125、p68和p50），这种复合物与PCNA的结合能力也大大提高。将该复合物进行质谱（LC/MS/MS）分析,得到一个分子量为12 kDa的多肽序列，通过数据库检索以及与栗酒裂殖酵母Polδ的第四亚基Cdm1蛋白序列的比对，最终确认p12是哺乳动物DNA聚合酶δ的一个组成部分[24]。p12不仅是DNA聚合酶δ的重要组成部分，能够影响它的催化性质，而且还参与到DNA损伤修复过程中。p12亚基能够在ATR/Chk1通路调控下以泛素化依赖的形式降解，从而使细胞内Pol δ由原来的四聚体形式Pol δ4转换为三聚体形式Pol δ3来应对由紫外照射、烷化剂或复制压力造成的DNA损伤，并在之后的DNA修复中发挥作用。