血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图特征

图9 双鞘流技术示意图

仪器通过两个通道来完成白细胞的五项分类。其采用的细胞化学染色技术（Cytochemistry）的原理是经典的细胞分类技术，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料（Chlorazol Black E）。在仪器的LMNE检测池中，全血样品与染色剂充分混匀，在35℃条件下进行孵育，此过程的作用是：① 溶解红细胞 ②对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）也进行不同程度的着色 ③ 固定细胞的形态，使其保持自然状态。由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同、每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光率。

染色后的标本被引导进入鞘流池进行双鞘流分析，首先经过60mm红宝石小孔进行电阻法分析，用于判断细胞体积大小，在LMNE散点图上的横坐标即可表示出细胞大小的特性。然后样本迅速进入直径为42mm的第二鞘流检测通道进行光吸收率测定，以判断细胞形态和内容物等情况。根据每类细胞在这两个分析参数上所表现出来的特性，形成二维分布的散点图。在此通道内可完成白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞群的分类。此通道内在分析的同时还能够检测两群异常白细胞亚群：巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值，异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值，同时还可提供多达82种提示和报警信息。

在LMNE散点图上，各类白细胞的特点是：①淋巴细胞：典型的淋巴细胞体积较小、形态规则、胞浆内没有颗粒，其吸光率最低，所以定位在散点图的右下部矩阵中，正常淋巴细胞散点图为正态体积分布。②单核细胞：典型的单核细胞体积较大、肾状核、胞浆内有初级颗粒（几乎不着色），细胞核大且不分叶，光散射较少，所以位于吸光率轴的最下端，依据单核细胞的体积，位于体积轴的最右端，而异常单核细胞及特大单核细胞则可能出现在LIC的矩阵中。③中性粒细胞：典型的中性粒细胞具有嗜中性颗粒及分叶核的结构，中性颗粒部分着色，同时由于颗粒及核的分叶等形态上的复杂性，而产生光散射。所以中性粒细胞群散点图位于中部。核分叶越多的中性粒细胞，吸光性越强，在散点图上的位置向右移。同时杆状细胞（Bands）体积与中性粒细胞接近，但核的复杂程度低，吸光率低，散点图位于中性粒细胞与单核细胞之间。④嗜酸性粒细胞：由于嗜酸性粒细胞含有特异性颗粒，与染色

液特异性着色，其着色强度最深，位于Y-轴的最上端，此方法提高了嗜酸性粒细胞的分类的准确性。⑤巨大未成熟细胞（Large Immature Cell）：未成熟粒细胞因其体积较大，可含有颗粒，光散射强，位于嗜中性粒细胞散点图的右侧，在LIC矩阵图中从左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒细胞，另外各种原始细胞位于单核细胞的右侧区域中。由于此散点图中可能有大单核细胞，可引起LIC假性计数增加（LIC的计数结果被计算到在嗜中性粒细胞中）。LIC包括：大单核细胞、高嗜碱性的单核细胞、巨大中性粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、原始细胞。⑥异型淋巴细胞(Atypical Lymphs)：在散点图中位于淋巴细胞与单核细胞之间的一群细胞，包括：小原始粒细胞、大淋巴细胞等。

在WBC/BASO检测池中，全血样品与BasolyseII（PH2.4）溶血素混合，在35°C恒温下，溶解红细胞，由于嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能够保持形态完整，而其他白细胞胞浆溢出，成为裸核状态。细胞通过一个直径为80mm的鞘流微孔时，根据电阻抗原理进行测定，以细胞体积大小为横坐标绘制WBC/BASO直方图。依据阈值设定区分裸核化的白细胞与嗜碱性粒细胞。在直方图上可以看出在中心界标左侧的是细胞体积变小的其它细胞群，界标右侧是体积较大的嗜碱性粒细胞。因嗜碱性粒细胞数量极少，因此在直方图上基本见不到明显分布曲线和峰。

图10 ABX血细胞分析仪LMNE散点图和BASO直方图

红细胞和血小板仍然采用电阻抗原理测定，血红蛋白采用比色法。此为在软件系统中采用了浮动界标技术用于血小板计数及嗜碱细胞计数，直方图的界标会依据细胞群的变化做出相应的自动调整。血小板计数上还采用了防返流装置，目的为防止涡流现象对血小板计数产生影响。在白细胞计数过程中还采用了白细胞平衡检测原理（WBC Count Balance），使得白细胞计数在WBC/HGB通道中与LMNE双鞘流池计数结果相联系，如果出现较大差别则可进行报警提示。

最近该厂推出新一代ABX Pentra DX120型血细胞分析仪，其测定原理仍然采用双鞘流

技术。采用新技术扩展了散点图分布范围，形成可对血液中未成熟的粒细胞、单核细胞和淋巴细胞共20个参数的分类或提示性报告信息，这对异常血细胞的筛检提供了很大帮助。

图11 Pentra DX120型幼稚细胞散点图

5 多角度偏振光激光散射技术

美国雅培公司（ABBOTT）推出的血细胞分析仪，在白细胞分类中采用独特的多角度偏振光散射（MAPSS）技术，其所生产的血细胞计数仪从CELL-DYN 3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（蓝宝石），在白细胞分类上均采用了MAPSS技术。该技术基本原理是细胞在激光束的照射下，在多个角度都产生散射光，仪器在四个角度的四个检测器将接收到的相应的散射光信号，然后经过微处理器分析处理，将各类细胞安置在散点图上的相应位置，并计算出白细胞分类结果。

多角度偏振光散射白细胞分类技术（Multi—Angle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞颗粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透压高于鞘液渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时的红细胞折光指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。在鞘流系统的作用下，样本被集中为一个直径30μm的小股液流，该液流将稀释的血细胞单个排列，然后通过激光束，激光照射于细胞上，在各个方向都有其散射光出现。0°为前向角散射（1°～3°）光，可粗略地测定细胞大小；②10°为狭角散射光（7°～11°），可测细胞结构及其复杂性的相对特征；③90°为消偏振光散射（70°`～110°），基于颗粒可以将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。④90°垂直光散射（70°～110°），主要对细胞内部颗粒和细胞成分进行测量。这四个角度同时对单个白细胞进行测量和分析后，即可将白细胞划分为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5种。ABBOTT的五分类法定量很有意思，不用传统的体积定量，而是采用数量定量，每次计数时完成10000

个细胞测定即停止。

图12 MAPSS测定原理示意图

该类型仪器除了基本的白细胞五分类外，还提供了其它异常白细胞的信息和报警，提供给检验者参考，以通过人工显微镜检查复核这些结果，例如异常淋巴细胞、原始细胞、未成熟粒细胞、杆状核中性粒细胞。