LPS对草鱼3种免疫因子的影响

LPS对草鱼3种免疫因子的影响

能力与TLR4对LPS的识别能力有关。其中，LBP、CD14和TLR4是LPS的3种受体（刘中原等，2010）。

TLR4识别病原菌LPS，通过胞内信号传递可直接触发胞内杀菌机制，诱导免疫炎性因子的产生以扩大非特异性防御作用，并诱导特异性免疫，是非常重要的天然免疫受体（Su et al.，2009）。TLR4信号转到通路需要激活MyD88独立和非独立性通道，从而引起炎症细胞因子（Takeda et al.，2004）。另外，在对肠道粘膜免疫的研究中发现，TLR4基因突变也可改变肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮TLR4分子结构，使机体的免疫系统失去正常处理肠腔内大量细菌和LPS等病原分子的能力，进而使肠黏膜在其长期刺激下产生感染和炎症。

近来认为，LPS信号转导途径中某些特定的反应因子表达下调或功能障碍，是产生LPS耐受的主要原因。大量研究表明，单核巨噬细胞系是内毒素作用的主要靶细胞，是产生内毒素耐受的主要效应细胞。产生耐受时，其微观特征表现为肿瘤坏死因子（TNF-a）、白介素l（IL-1）、IL-6等细胞因子低表达或者无表达（李维朝等，2010）。

1.2 鱼类的免疫系统

现今鱼类具有免疫系统已经成为众所周知的了，虽然鱼类没有和高等脊椎动物那样的骨髓或者是淋巴结，但是研究发现鱼类的肾脏、脾脏和胸腺是鱼类免疫系统中的重要器官。鱼类的免疫机制可以分为非特异性和特异性免疫两种，非特异性免疫就是机体的天生的免疫力，是包括解剖上的防御即体表鳞片和其分泌的粘液，以及生理性的防御主要是各种可溶性的免疫因子，特异性免疫指的是病原体经过吞噬细胞等的摄取和处理，暴露出这种病原体所特有的抗原，将抗原传递给T细胞，刺激T细胞产生淋巴因子，少数抗原直接刺激B细胞，B细胞受到刺激后，在淋巴因子的作用下，开始一系列的增殖、分化，大部分分化为浆细胞，产生抗体，小部分形成记忆细胞。目前已发现的与鱼类免疫相关的体液免疫因子主要有IgM、补体、干扰素、溶菌酶、C反应蛋白、白细胞介素2、8、10、淋巴毒素、巨噬细胞活化因子、趋化因子等。研究表明鱼类只产生一种IgM类型的抗体。将LPS投喂或腹腔注射给鱼类后，可以增加鱼类血液中白细胞的数量和提高其吞噬活性，增强日本鳗鲡(Anguilla japonica)对爱德华氏菌病的抵抗力。

3

华中农业大学2012届本科毕业论文

1.3 鱼类的几种免疫因子

1.3.1 白细胞介素10

白细胞介素(interleukin，IL)是一类具有重要免疫生物学功能的细胞因子，目前在鱼类中已发现了若干种IL，如IL-2、IL-1、IL-8和IL-10等。IL-10是1989年Fiorentino等发现的一种可以抑制Th1细胞合成细胞因子，由活化后的B细胞产生，参与多种免疫反应，其主要生物活性是免疫抑制作用。IL-10还有免疫刺激的作用，促进B细胞的增殖分化，抑制由LPS诱导的组织因子的表达。

1.3.2 γ干扰素

干扰素(interferon，IFN)是一种在细胞或者机体受到病毒后由淋巴细胞和单核细胞分泌的重要的细胞免疫因子，干扰素能增强机体抗病毒能力、抑制肿瘤细胞生长和进行免疫调节。鱼类干扰素最早是Gravell等在其研究传染性胰腺坏死的实验鱼胖头鱼岁(Pirnepboles promelas)鳍的传代细胞中发现的，目前IFN已经被诸多学者从多种鱼类（虹鳟、牙鲆、草鱼、黑鲫(carassius carsius )等）中发现且分离出了，并研究其理化和生物学特性。草鱼IFN-γ主要由头肾等免疫组织中的淋巴细胞和单核细胞分泌，是一种广谱抗病毒剂，并且能促进巨噬细胞吞噬杀菌、调节淋巴细胞转化。

1.3.3肿瘤坏死因子α

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是一种促炎细胞因子，由机体巨噬细胞和单核细胞产生，并参与正常的炎症反应和免疫反应。最初学者们只能间接证明鱼类中存在TNF-α，因为学者们发现从其他动物体内提取的TNF-α能参与到鱼体的免疫系统中去，并且还能增强它。直到Hirono等在牙鲆体内发现TNF-α及其受体的基因才真正意义上说明鱼类中存在TNF-α。研究表明TNF-α基因在不同鱼中是有不同拷贝的。当用LPS刺激鱼体巨噬细胞后，发现双拷贝的TNF-α基因的表达要强于单拷贝的TNF-α基因。

4

LPS对草鱼3种免疫因子的影响

1.4草鱼的养殖现状

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国主要的淡水养殖鱼类之一，草鱼营养价值高，且在我国养殖量巨大，但是草鱼免疫功能比较弱并且现在主要实行高密度养殖模式，草鱼在这种人工养殖条件下，极容易患各种病毒性鱼病和细菌性鱼病：

1.病毒性鱼病，由呼肠孤病毒，草鱼出血病毒引起，称草鱼出血病，是饲养草鱼从鱼苗下塘到成鱼饲养阶段危害最大的疾病，死亡率可达70%以上。

2.细菌性鱼病，主要有烂鳃、肠炎、赤皮病，其病原体有报道由嗜水气单胞菌，温和气单胞菌和卢克氏耶尔森氏菌致病引起；也有报道由柱状屈尧杆菌、粘球菌、肠型点状气单胞菌、荧光假单胞杆菌引起，由于致病菌种类多，数病并发，治疗难度大。

对于这几种鱼病现阶段没有特效方案，但是通过免疫的方法可以进行预防和治疗。所以本文通过研究LPS对草鱼3种免疫因子（IL-10、IFN-γ、TNF-α）的影响，可以进一步清晰的了解LPS的作用机制，为将来全面充分利用LPS制作免疫制剂奠定基础，并且还将为寻找到新型的免疫制剂提供基础理论支持，预防鱼病，造福人类。

2材料与方法

2.1 实验材料

健康草鱼体重约为20-30g，基础饲料，大肠杆菌（E055:B5）LPS购自Sigma公司，Trizol试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（购自宝生物公司）。

2.2 实验鱼及分组

试验鱼用食盐水消毒，饲养于华中农业大学水产养殖基地，流水养殖，全天充氧。将体长大小基本一致的健康草鱼随机分成2组（LPS组和对照组），每组30尾，投喂基础饲料(表1)2次/天（按体重的3%-5%），暂养两周后开始试验。

5

华中农业大学2012届本科毕业论文

表1 基础饲料成分

Table 1 Composition of feed

原料 鱼粉 豆粕 菜粕 面粉 豆油 CaH2PO4 多维多矿盐 氯化胆碱 羧甲基纤维素钠

1）2）

% 8.0 25.0 35.0 25.0 3.2 2.0 0.1 0.3 0.2 0.2 1.0

近似成分 粗蛋白 粗脂肪 湿度 灰分

% 湿重 29.83 7.21 9.95 8.12

1）多维组成 (mg kg-1): 维生素 A 6500IU,维生素 D3 4500IU,维生素C 120mg, 维生素E 25mg, 维生素 K3 5mg,维生素 B1 12.5mg, 维生素 B2 12.5mg, 维生素 B6 15.0mg, 维生素 B12 0.025mg,

烟酰胺50mg, 泛酸盐40mg, 肌醇75mg, 叶酸2.5mg, 生物素0.08mg.

2) 多矿组成 (mg kg?1)：NaCl 1.0, MgSO4 15.0, NaH2PO4·2H2O 25.0, AlCl3.6H2O 0.06, KH2PO4 32.0, Ca(H2PO4)2.H2O 20.0, C6H5FeO7·10H2O 2.5, CaC6H10CaO6·5H2O 3.5, ZnSO4·7H2O 0.353, MnSO4·4H2O 0.162, CuSO4·5H2O 0.031, CoCl2·6H2O 0.001, KIO3·6H2O,

0.003, 纤维素, 0.39.

2.3 LPS刺激

参考陈昌福等(1989)和预实验确定LPS敏感剂量为5 mg/ kg，生理盐水稀释配置LPS，腹腔注射LPS 0.2-0.25mL，对照组注射等量生理盐水。注射后观察鱼的健康状况，并按实验要求定期取样。

2.4 取样

LPS刺激后36h（Su et al.,2009）取样，每组随机取3尾鱼，MS-222麻醉后冰浴解剖，取肝脏、肠道、鳃、心脏、肾脏、肌肉组织，做好标记，液氮速冻，存于-80℃，用于检测各组织IFN-γ、TNF-α和IL-10的mRNA。

2.5 RT-PCR检测各组织IFN-γ、TNF-α和IL-10的表达

2.5.1引物设计

6