外泌体蛋白质组学研究进展 - 图文（精）

临床检验杂志2016年12月第34卷第12期Chin J Clin Lab Sci,Dec.2016,V01.34,No.12

DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2016.12.11 外泌体蛋白质组学研究进展宰 ?927? ?综述?

覃思华,郑磊(南方医科大学南方医院检验科,广州510515

摘要:外泌体(exosome是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡。可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白 质和脂质等。大多数外泌体有特殊的功能,可能与细胞信号转导功能相关。现已发现外泌体参与疾病进展、肿瘤血管生成、 免疫监视等多个环节。外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。该文总结外泌体蛋白质组学的研究思路及方法, 综述目前外泌体蛋白质的临床作用,并对外泌体蛋白质组学研究面临的挑战和前景进行分析与评述。

关键词:外泌体;蛋白质组学;疾病 中图分类号:R446文献标志码:A

20世纪80年代,Johnstone等¨1发现网织红细胞在成熟 过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白,并首次将这种囊泡 亚型命名为exosome(即外泌体。外泌体可通过传递信息影 响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等 生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质差异表达是区分 不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途 径旧J。与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出 来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋 白质组学研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发 展。但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋 白质的研究将具有巨大的前景。

1外泌体及其结构功能

外泌体是细胞进化过程中内出芽形成的多泡体释放的 一类直径为30~100am的脂质双层膜的小囊泡,可由各种 类型的细胞分泌,也可在各种体液中分离出来,包括血液、尿 液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。外泌体携带着大量的细 胞特异的生物活性分子,如核酸、蛋白质、脂类和糖类等,这 些物质经过亲代细胞选择和特殊包装而进入外泌体,是激发 信号转导机制的关键,在机体很多生理病理过程中发挥重要 的作用,如免疫调节[3J、动脉粥样硬化H o、肿瘤药物抵抗垆1、 抗病毒㈣等。

外泌体起源于胞内体途径。细胞内吞的囊泡被分类并 到达溶酶体和细胞膜。瑚J。早期核内体与细胞内吞的囊泡融 合,将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收,成为再生的 早期核内体。这些核内体经历一系列转化后成为晚期核内 体。在此转化过程中,晚期核内体逐渐形成多泡小体(mul-tivesicular bodies,MVBs,而其中30~100nln的囊泡从多泡 小体的管腔出芽一J。多泡小体可以与溶酶体融合,参与溶酶 体途径,或参与分泌途径,与质膜融合¨1。溶酶体途径将导 致内容物降解,而分泌途径中形成外泌体释放到细胞外微环 境。以上一系列从核内体复合物到外泌体的形成过程需要 内体分选转运蛋白复合物(ESCRT和其他相关蛋白质如 Alix[7]。外泌体是由胞外分泌产生的,不同的脂质与脂质相 关的酶也控制着外泌体的分泌过程¨…。也有的理论强调胞 质蛋白半乳凝集素5(galectin-5参与了核内体和外泌体的释 放¨1。,所以蛋白质对于外泌体的产生和发挥生理功能都有 着重要作用¨“。

目前的研究常以外泌体蛋白在细胞中的定位进行分类。 外泌体中细胞质蛋白最丰富,在体液中可达47%,在细胞上 清中为43%,其次是膜蛋白(体液和细胞上清中分别为28%和34%,核酸和线粒体蛋白则较低,大部分的膜蛋白和细 胞质蛋白在外泌体中较保守,这在不同来源的外泌体中均已 被证实¨3|。另一种分类方法主要将蛋白质分为两大类。一 类是非特异性蛋白质,大部分是来源于亲代细胞中保守区域 的细胞质和膜蛋白,如细胞骨架蛋白[肌动蛋白(actins、微 管蛋白(tubulins、埃兹蛋白(ezrin、膜突蛋白(moesin],新 陈代谢相关的酶[磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH、烯醇化酶1 (enolase 1、磷酸甘油酸激酶1(PGKl、丙酮酸激酶2 (PKM2],核糖体蛋白,跨膜蛋白[多聚免疫球蛋白受体 (PIGR、溶酶体相关膜蛋白1(LAMPl、CD59],膜联蛋白 (annexins,热休克蛋白,粘附蛋白[整合素(integrin8、乳腺 肪球因子8(MFGE8]等,这些

蛋白质可能参与上述的外泌 体的合成过程。另一类则是不同来源外泌体的特异性蛋白 质,经质谱研究发现其携带了4400余种特异性蛋白质¨“。 这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关,在免疫、凝血、肿 瘤等生理病理过程中发挥作用,在不同的生理病理条件下有 表达差异,因此更具备生物学标志物的潜力。体液中的外泌 体蛋白质受血液高丰度蛋白质干扰少、表达稳定,使其较血 液中传统的可溶性诊断分子更有意义。外泌体还携带了特 异的信息,介导疾病的发生发展,具有作为生物学标志物的 潜力。

2外泌体的分离及鉴定

2.1外泌体的分离和纯化外泌体蛋白质组学研究的前提 是获取均匀的无污染的囊泡蛋白产物,故要排除病毒、杂蛋 白和外泌体聚集等影响。不同提取方法获得外泌体的回收 率、纯度和颗粒完整性差异较大,目前仍缺乏统一标准的分 离方法¨“。Lobb等¨刮对蔗糖密度梯度离心法、差速超速离 心法、尺寸排阻(size exclusion isolation,SEC法、沉淀法、超

木基金项目:国家自然科学基金(81371901;广州市科技计划资助项目

(1563000220;广州市健康医疗重大专项(201604020015。 作者简介:覃思华,1991年生,女,技师,硕士,研究方向:细胞外囊泡作为疾病诊断标志物。

通信作者:郑磊,教授,博士,E?mail:nfyyzhenglei@8ran.edu.C11。 万方数据

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滤法获得的产物进行了初步的表征分析,提出使用每微克蛋 白质的颗粒浓度来衡量分离产物的纯度,结果发现沉淀法的 回收产率最高但纯度最低,提示得到的产物中有大量的蛋白 质并不属于外泌体;超高速离心可能会造成较大损耗,也损 伤囊泡,导致分离效果稳定性差;而血浆外泌体分离SEC法 产物纯度可与超速离心法相媲美,甚至高于蔗糖密度梯度离 心法。也有一些研究以外泌体表面标志蛋白质为基础,利

用 与磁珠或其他固定相以共价键或高亲和作用连接的抗体,再 通过低速离心或磁场的物理方法将固相流动相分离,达到免 疫亲和分离外泌体的目的¨“。进行蛋白质组学研究的分离 要求远高于核酸分析,因为回收产物中蛋白质污染最难去 除,也很难保持产物的同质性,这是外泌体蛋白组学研究受 限的最主要的原因¨2|。Abramowicz等Ⅲ1对差速超速离心 法、蔗糖密度梯度离心法或碘克沙醇离心法、化学沉淀法、凝 胶过滤法、免疫捕获法获得外泌体进行分析,认为目前阶段 适宜开展蛋白质组学的研究方法为差速超速离心法与碘克 沙醇或蔗糖密度梯度离心或凝胶过滤相结合,此法为制备超 大量外泌体进行大规模质谱分析提供了可行的方案。

2。2外泌体的鉴定成功分离出均匀无污染的外泌体后要 对产物进行鉴定,鉴定一般从以下几个方面进行:定量外泌 体浓度和粒径、电镜直接观察其大小形态和鉴定表面蛋白质 标志。纳米颗粒跟踪分析技术常用于定量外泌体浓度和粒 径,根据粒子布朗运动轨迹计算外泌体浓度和粒径,易受其 他污染蛋白质或与外泌体粒子直径相近的粒子影响¨5|。电 镜对于外泌体的形态学、大小、标志物存在的观察都很有价 值,但在浓度测量方面价值有限。而仅通过外泌体表面的常 用蛋白质标志[CD63、CD9、肿瘤易感基因101(TSGl01等]的免疫印迹实验不能判断这些蛋白质是否来自外泌体,也不 能判断其是否存在污染¨…。因此实验中需将几种鉴定方法 联合使用。

3外泌体蛋白质组学分析

常用的技术有双向凝胶电泳、液相色谱、质谱等。在外 泌体研究中,单一的技术无法满足研究全面需要,故实验室 内常将几种技术联合使用。

3.1外泌体蛋白质表达模式研究 蛋白质表达模式是研究 外泌体内的蛋白质的组成并了解其生物学信息。通过凝胶 电泳或质谱手段,获取不同样本来源外泌体内不同的蛋白质 组成,分析其成为生物学标志物的可能性,发现特异的蛋白 质成分或表达量的差别从而应用于临床。Melo等¨引通过超 高液相质谱联用发现一种细胞膜锚定蛋白磷脂酰肌醇蛋白 聚糖1(glypican.1,GPCI在肿瘤细胞分泌的囊泡中特异性高 表达,随后在胰腺癌患者血清外泌体中验证了该蛋白质具有 极高的特异性和敏感性,将