额尔敦-乌日勒对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑干和下丘脑TGF-β及PDGF的影响

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另外，本课题实验并不是分别去研究不同部位脑缺血所发生的病理变化，本课题实验要研究的是额尔敦-乌日勒防治CIS的作用机制，观察药物对各部位脑组织神经营养因子的影响并对比其差异。CIS是由血栓或栓塞阻塞主要血管而引发的代表性疾病，其80%以上是由动脉阻塞所致，阻塞的血管通常是大脑中动脉（middle cerebral artery,MCA），所以大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型被普遍认为是研究局灶性脑缺血的标准动物模型[8、9]。因此，本实验选用MCAO/R大鼠模型模拟人类CIS。

造模动物之所以选用SD大鼠，首先，因为有研究发现，Wistar大鼠造模梗死灶的变异会很大，脑梗死的体积很小；F344大鼠造模的变异很小，脑梗死的体积很大；SD大鼠的造模效果则介于这二者之间，使用SD大鼠可以更全面的反映出不同模型的优势与劣势[10]。另外，它是中国实验最常用的大鼠，方便购买、容易饲养、品系保持较好。

选用雄性大鼠是因为有学者发现雄性大鼠的脑梗死体积稍大，所以其神经损伤症状较雌性大鼠明显[11]。并且在MCAO/R造模过程中，手术损伤较大，雄性大鼠比雌性大鼠的耐受力更强，便于操作。

对于造模大鼠周龄的选择，目前存在分歧。虽然脑中风好发于老年人，但周龄过大的大鼠可能会由于血管管腔狭窄、大脑中动脉迂曲或者动脉粥样硬化等病理改变而导致个体模型梗死面积与神经损伤存在较大的变异系数。因此不可以盲目的选用老龄大鼠。很多相关的实验表明，10周龄左右的成年大鼠存在着良好的一致性[12、13、14]。

MCAO/R大鼠模型的造模过程虽然目前还没有标准化，但经过近30余年的发展，已经比较成熟合理。综上所述，所以实验选择SPF级10周龄左右健康雄性SD大鼠，采用改良的Zea-Longa线栓法制备MCAO/R大鼠模型模拟人类CIS。 3.2 TGF-β与PDGF的生理作用

有研究发现，缺血性脑中风患者在发病初期TGF-β会显著在患侧缺血区，尤其是缺血半暗带聚集，其在健侧的含量则会明显减少

[15]

。随着病情的发展，它的表达会有少量

的增加。但因为病情轻重不仅与梗死面积有关，它还与梗死位置有关，所以TGF-β的水平与病情轻重没有明显的相关性。通过大量的实验证明，虽然TGF-β可能参与组织纤维化的过程[16]，但其可促进脑血管的生成并扩张脑血管，从而增加血流量缓解脑缺血症状

[17]

；TGF-β可以增加细胞抗凋亡基因的表达，抑制神经损伤促进神经修复[18]；TGF-β可

调节免疫系统，促进星形胶质细胞（Astrocyte，AST）产生白细胞介素-6（Interleukin-6，

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IL-6），进而保护中枢神经系统；TGF-β还有抗炎、抗氧化、抗粘附分子以及调控细胞周期的作用[19]。TGF-β的这些作用对缺血性脑中风患者的恢复都是极为有利的，因此可以确认，缺血性脑中风时它的表达增加是机体的一种保护性反应[20]。

已有实验证明，发病初期机体会大幅度上调PDGF的含量，其在缺血半暗带的含量会明显高于正常部位。它可以通过促分裂去生成血管，而减小梗死灶的面积，对神经元起到一定的保护作用[21、22、23]。但是，PDGF会引起血管的收缩，它是一个比血管紧张素Ⅱ更强的血管活性物质；PDGF能够诱导巨噬细胞与成纤维细胞向创伤部位游走，配合血小板的凝血作用，对创伤进行修复[24、25、26]；PDGF还可以促进胶质细胞、成纤维细胞以及结缔组织细胞分裂增殖[27、28、29]。笔者认为，PDGF的上调幅度以及这些功能对于缺血性中风患者的恢复是极为不利的，它很可能会导致动脉粥样硬化、脑血栓或脑栓塞的发生并加重脑缺血的症状。

3.3 额尔敦-乌日勒对MCAO/R大鼠脑组织的影响

在课题实验初期，已通过检测海马与皮质部位，证明了额尔敦-乌日勒有明显的抗脑缺血损伤作用。通过TTC染色观察到假手术组未见苍白色组织，其细胞形态、结构、排列均正常。模型组出现较大面积的苍白色组织，胞膜分界明显，胞浆浓缩红染，细胞核碎裂溶解或固缩成三角形，神经纤维软化、空泡化现象严重，有大量的炎性细胞或淋巴细胞浸润，神经细胞稀疏或变性、萎缩、坏死。各给药组苍白色组织面积明显小于模型组，其中额尔敦-乌日勒组苍白色组织面积最小，证明其可显著减轻神经细胞损伤程度，减少神经元缺失，减轻间质水肿，减轻核固缩，抑制胶质细胞肿胀，减少中性粒细胞及淋巴细胞浸润，增加正常细胞数量[6]。

本实验证明了，额尔敦-乌日勒可较全面调节各部位的脑组织。其可明显增强TGF-β mRNA的表达进而提高脑干及下丘脑部位的TGF-β含量；并抑制PDGF mRNA的表达进而降低这两个部位PDGF的含量。因为TGF-β可抗炎、抗氧化、抗粘附分子，调节免疫系统，调控细胞周期，促生并扩张脑血管，抑制神经损伤，促进神经修复，有利于患者恢复；而PDGF会引起血管的收缩，促进凝血，促进胶质细胞、成纤维细胞以及结缔组织细胞分裂增殖，不利于患者恢复。所以可以确定额尔敦-乌日勒能较全面的调节脑组织神经营养因子的含量，向着有利于脑中风患者恢复的趋势发展[30]。 3.4 对额尔敦-乌日勒药物作用的评价

在灌胃给药2周后，假手术组大鼠死亡率为0%，并且其精神状态、身体活动、进食

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饮水、大小便以及毛发光泽度基本正常。模型组大鼠的死亡率最高，为33.33%，其精神状态较差、动作迟缓、进食减少、形体消瘦、毛色暗无光泽。各给药组大鼠的症状普遍得到了缓解。其中，额尔敦-乌日勒3组的平均死亡率仅为11.11%，这低于吡拉西坦组的死亡率22.22%。实验数据显示，额尔敦-乌日勒除了中剂量组TGF-β mRNA的相对表达量，其他低、中、高剂量组的TGF-β、PDGF含量以及PDGF mRNA的相对表达量与模型组相比差异都是有统计学意义的（P＜0.05），而吡拉西坦组所有的数据与模型组相比都没有统计学意义（P＞0.05）。这些都提示了额尔敦-乌日勒可通过神经营养因子途径，保护并修复受损神经元，有效地治疗脑中风（萨病、白脉病）[31、32、33]，其对神经营养因子的影响强于西药吡拉西坦。

具体分析额尔敦-乌日勒低、中、高剂量组的差异。虽然统计学分析显示脑干部位TGF-β含量，低剂量组与高剂量组的差异无统计学意义（P＞0.05）；下丘脑部位TGF-β含量，额尔敦-乌日勒低、中、高剂量组的差异无统计学意义（P＞0.05）。但综合对比实验数据、观察实验数据柱形图可发现，TGF-β含量及其mRNA的相对表达量低剂量组的数值比中、高剂量组高出很多，并且低剂量组TGF-β mRNA的相对表达量与中、高剂量组相比差异是有统计学意义的（P＜0.05）。所以从TGF-β的角度考虑，低剂量额尔敦-乌日勒对TGF-β的影响作用最强，对脑中风患者的恢复最为有利。脑干与下丘脑部位的PDGF含量，以及PDGF mRNA的相对表达量，额尔敦-乌日勒低、中、高剂量组的数值差异均无统计学意义（P＞0.05）。虽然中剂量组PDGF含量及其 mRNA的相对表达量是最低的，但PDGF的生理功能对脑中风患者并不完全有害，它可促分裂生成血管，减小梗死灶面积，其含量在发病初期也会应激性上调，对机体起到一定的保护作用。额尔敦-乌日勒低剂量组的数值稍大于中剂量组，所以从PDGF的角度考虑，虽然中剂量额尔敦-乌日勒对PDGF的影响作用最强，但笔者认为同样还是低剂量额尔敦-乌日勒对脑中风患者的恢复最为有利。

4.结论

本实验数据显示，额尔敦-乌日勒对神经营养因子有着较大的影响。其可促进诱导具有协同作用神经营养因子的内分泌，通过上调TGF-β mRNA的相对表达量进而提高TGF-β含量，下调PDGF mRNA的相对表达量进而降低PDGF含量途径发挥其靶源性营养作用和神经保护作用，保护并修复受损神经元、减轻脑缺血再灌注损伤。额尔敦-乌日勒养心安神、舒筋活络的功效与其调节神经营养因子内分泌有关。本实验解释了额尔敦

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-乌日勒抗脑缺血的作用机制，为其临床应用提供了实验依据。

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