降血糖动物实验

辅助降血糖作用检验方法

1动物实验 1.1动物选择

选用健康成年动物，常用小鼠（25±2g）或大鼠（180±20g），单一性别，大鼠每组8-12只、小鼠每组10-15只。 1.2材料 1.2.1试剂

四氧嘧啶（或链脲霉素）小鼠35-50mg/kg.bw.iv（100-160mg/kg.bw.ip）、大鼠50-80mg/kg.bw.iv（200-250mg/kg.bw.ip）用新鲜配制。 血溏测定试纸或试剂盒。 1.2.2仪器

血糖仪、全自动生化仪、721-B型分光光度计。 1.3剂量分组及受试样品给予时间

设1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组，根据人体每日每公斤体重推荐摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量组（大鼠扩大5倍），根据受试样品的具体情况另设两个剂量组。受试样品给予时间原则上不少于30天，也可根据实验需要自行设定期限。 1.4实验方法

1.4.1降低空腹血糖实验 1.4.1.1高血糖模型动物 1.4.1.1.1原理

四氧嘧啶（或链脲霉素）是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛β细胞，造成胰岛素分泌低下引起实验性糖尿病。 1.4.1.1.2造型

动物禁食24小时后，给予四氧嘧啶造型，5-7天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。 1.4.1.1.3操作步骤

选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组（组间差不大于1.1mmol/L）。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较各组动物血糖值及血糖降低的绝对值（即实验前后血糖的差值）。 1.4.1.2正常动物

选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个受试样品组（高剂量）。余操作同1.4.1.1.3。 1.4.2糖耐量实验

高血糖模型动物禁食3-5小时，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶

剂，15-20分钟后经口给予葡萄糖2.0g/kg或医用淀粉3-52.0g/kg，测定给葡萄糖后0、0、5、2小时的血糖值或人医用淀粉后0、1、2小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点血糖曲线下面积的变化。

血糖曲线下面积=1/2×（0小时血糖值+0.5小时血糖值）×0.5+1/2×（2小时血糖值+0.5小时血糖值）×1.5=0.25×（0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值）. 1.5数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 降空腹血糖实验：受试样品剂量组与对照组比较，空腹血糖实测值降低有统计学意义，可判定该受试样品降空腹血糖实验结果阳性。

糖耐量实验：受试样品剂量组与对照组比较，在给葡萄糖或医用淀粉后、0.0、0.5、2.0小时血糖曲线下面积降低有统计学意义，可判定该受试样品糖耐量实验结果阳性。 1.6注意事项

1.6.1为了使实验动物糖代谢功能状态尽量保持一致，也为了准确地按体重计算受试样品的用量，实验前动物应严格禁食（不禁水），实验前后禁食条件应一致，鼠类在禁食的同时应更换衬垫物。

1.6.2血糖测定用试纸或试剂盒，按说明书操作；若自行配制试剂，按[附1]操作。 1.6.3如用血清样品进行测定，应于取血后30分钟内分离血清，分离后血清的含糖量在6小时内不变。用血清制备的无蛋白血滤液可保存48小时以上。

1.6.4高浓度的还原性物质如Vit C亦能与色素原竞争游离氧，干扰反应，使结果偏低。血红蛋白能使过氧化氢过早分解，亦干扰反应，致使测得血糖值偏低。故对已溶血的全血或血清必须制备无蛋白滤液后，再进行测定。 [附1]血糖值测定方法 1原理

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶作用下放出氧，使4-氨基安替比林与酚氧化缩合，生成红色醌类化合物，可在波长505nm比色测定。 2试剂配制

磷酸盐缓冲液（0.2mol/L, PH7.0）

0.2mol/L Na2HPO4 61ml，0.2mol/L KH2HPO4 39ml混合即可。 酶试剂

葡萄糖氧化酶400u，过氧化物酶0.6mg,4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg加磷酸盐缓冲液至100ml，PH调至7。冰箱存放至少可稳定2个月。 酚试剂

酚100mg溶于100ml蒸馏水中。 酶混合试剂

取等量酶试剂和酚试剂混合。在冰箱中可存放1个月。 葡萄糖标准液

储存液：无水D-葡萄糖（A.R.）在烤箱中80℃烤4小时，冷却后，存放于干燥器中至恒重。精确称取2g以0.25%苯甲酸溶液溶解并移入100ml容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀释至100ml。

应用液：在100ml容量瓶中准确加入储存液5ml，再用0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml，即1mg/mL应用液。 蛋白沉淀剂

溶解磷酸氢二钠10g、钨酸钠10g、氯化钠9g于800ml蒸馏水中，加入1mol/L盐酸125ml，并用蒸馏水稀释至1000ml。 3操作步骤

取蛋白沉淀剂1ml加入血浆（血清）50ul混匀。室温放置7分钟后，离心，取上清液（无蛋白血滤液）测定。葡萄糖标准应用液亦进行同样处理。

无蛋白血滤液mL 测定管 0.5 标准管 - 0.5 4 空白管 - - 0.5 4 处理后的葡萄糖标准液mL - 蛋白沉淀液mL 酶混合试剂mL

4 混匀后，37℃水浴保温15分钟，用空白管调零点，在波长505nm处比色。 4结果计算 2人体试食试验 2.1试验设计

试验采用随机分组，组间和自身两种对照设计。 2.2受试产品

受试产品必须是具有定型包装、标明服用方法服用量的定型产品；安慰剂除功效成分外，在剂型、口感、外观和包装上与受试产品保持一致。 2.3受试者选择 2.3.1纳入标准

选择经饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药物品种及剂量，仅服用维持量的成年II型糖尿病病人，空腹血糖≥7.8mmol/L（140mg/dl）或餐后2h血糖≥11.1mmol/L（200mg/dl）；也可选择7.8mmol/L≥空腹血糖≥6.7mmol/L（120mg/dl）或11.1mmol/L≥餐后2h血糖≥7.8mmol/L的高血糖人群。 2.3.2排除标准

2.3.2.1 I型糖尿病病人。

2.3.2.2年龄在18岁以下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，对受试样品过敏者。 2.3.2.3有心、肝、肾等主要脏器并发症，或全并有其它严重疾病，精神病患者，服用糖皮质激素或其它影响血糖药物者。

2.3.2.4不合作者（指不能配合饮食控制而影响观察结果者）。 2.3.2.5近3个月内有糖尿病酮症、酸中毒以及感染者。

2.3.2.6凡不符合纳入标准，未按规定服用受试样品，或资料不全影响观察结果者。 2.4受试者分组

按受试者的血糖水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如病程、服药种类（黄脲类、双胍类）等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受度者不少于50例。、 2.5试验方法

试验前对每一位受试者按性别、年龄、不同劳动强度、理想体重参照原来生活习惯规定相应的饮食，试食期间坚持饮食控制，治疗糖尿病的药物种类和剂量不变。试食组在服药的基础上，按推荐服用方法服用量每晶是食受试样品，对照组在服药的基础上，可不进行任何处理（或服用安慰剂）。连续观察时间不少于30天，必要时可以适当延长。 2.6观察指标

各项指标于实验开始及结束各检测一次，必要时实验中期血糖指标可加测一次。 2.6.1安全性指标

2.6.1.1一般状况体征 包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等 2.6.1.2血、尿、便常规检查 2.6.1.3肝、肾功能检查

2.6.1.4胸透、心电图、腹部B超检查（仅试验前检查一次） 2.6.2功效指标 2.6.2.1症状观察

详细询问病史，了解患者饮食情况，用药情况，活动量，观察口渴多饮、多食易饥、倦怠乏力、多尿等主要临床症状，按症状轻重积分，于试食前后统计积分值，并就其主要症状改善（改善1分为有效），观察临床症状改善率。

临床症状积分表 无症 （积0分） 口渴多饮 无 轻症 （积1分） 中症 （积2分） 重症 （积3分） 有口渴感，饮水量口渴感明显，饮水量口渴显著，饮水<1000ml/日 1000-2000ml/日 量>2000ml/日

多食易饥 无 倦怠乏力 无 餐前有轻度饥饿感 餐前有明显饥饿感 昼夜均有饥饿感 精神不振，可坚持精神疲乏，勉强坚持精神极度疲乏，不体力劳动 日常工作 尿量 2500-3000ml/日 能坚持日常活动 尿量 >3000ml/日 多尿 症状消失，尿量尿量 <1800ml/日 1800-2500ml/日

2.6.2.2空腹血糖

观察试食前后空腹血糖值及血糖下降的百分率。 2.6.2.3餐后2h血糖

观察试食前后食用100g精粉馒头后2小时血糖值及血糖下降的百分率。 2.6.3.4尿糖

用空腹晨尿定性，按—、±、+、++、+++、++++分别积0、0、5、1、2、3、4分，于试食前后统计积分值。 2.6.2.5血脂

观察试食前后血清总胆固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇水平。 2.7数据处理和结果判定

凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态或方差齐的要求，改用t’检验或秩和检验；方差剂但变异系数太大（如CV>50%）的资料应用秩和检验。 结果判定

空腹血糖结果判定：①空腹血糖试验前后自身比较，差异有显著性，且试验后平均血糖下降≥10%，②试验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差异有显著性。满足上述两个条件，可判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。

餐后2h血糖结果判定：①餐后2h血糖试验前后自身比较，差异有显著性，且试验后平均血糖下降≥10%，②试验后试食组血糖值或血糖下降百分率与对照组比较，差异有显著性。满足上述两个条件，可判定该受试样品餐后2h血糖指标结果阳性。