评 测定腐竹丝中菌落总数的不确定度评定

测定腐竹丝中菌落总数的不确定度评定

1 测量及不确定度评定对象

本不确定度评定的对象为腐竹丝中的菌落总数

测量方法依据：GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验—菌落总数的测定》

2 测量方法的描述

2.1 培养基和试剂

平板计数琼脂培养基（PCA）：用天平称取PCA 23.50 g于称量纸上，放入PCA专用锅内，加入1000 mL蒸馏水，于电磁炉上边搅拌边加热，煮沸并充分溶解后，关闭电源。用玻璃棒沾少许培养基于精密pH试纸上（玻璃棒不能接触pH试纸），与标准色板对照，使用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L盐酸溶液调节至pH 7.0±0.2。分装在500 mL三角瓶内，每瓶分装约250 mL，不宜过多或过少。瓶口用软胶塞盖上，不宜盖的过紧，外层加盖包装纸，并用棉线绳将包装纸扎在瓶口上。于121 ℃高压灭菌15 min。 2.2 检测步骤 2.2.1 样品的稀释

称取25 g样品置无菌均质袋中，加入225 mL生理盐水，用拍击式均质器拍打1~2 min，制成1:10的样品匀液。

用1 mL无菌吸管吸取1：10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（吸管的尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

按以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管。

根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液加入两个无菌平皿内。同时分别取1 mL稀释液加入两个无菌平皿作为空白。

及时将15~20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注上述平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2.2.2 培养

琼脂凝固后，将平板翻转，置于培养箱内36℃±1℃培养48 h±2 h。水产品30℃± 1℃培养72 h±3 h。

如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，进行培养。 2.2.3 菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位“CFU”表示。

选取菌落数在30~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 2.3 结果的表述

2.3.1 菌落总数的计算方法

检测结果表明只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。

N?B?(n1?n2)2V …………….…………..……………………………（1）

N— 样品单位质量的菌落数 B— 样品的稀释倍数

n1、n2—分别为两个平行检测的平板上的

V—平板中所加样品稀释液的体积

2.3.2 菌落总数的报告

菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。

大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后采用两位有效数字。

若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。 3 不确定度来源分析

从测量过程分析，对腐竹丝中菌落总数测量结果有影响的主要不确定度分量主要有三个，即：稀释过程引入的不确定度、加样体积的不确定度和测量结果重复性引入的不确定度，根据微生物测量数据的特点，即测量结果分散性较大，与前三者相比而其他不确定度来源（如：人员操作、环境温度，湿度等）对测量结果的影响甚微，可以忽略不计。如下图所示： 稀释过程 VX 加样体积 V

容量允差 重复性 容量允差 校准 校准 温度 温度

重复性 X

结果重复性rep

4 测定腐竹丝中菌落总数的定量数学模型

N?B?(n1?n2)2V???rep ……………..……………………………（2）

??fVX?fV?fViJ?fViT?fVirep?fVJ?fVT?fVrep

V1—表示样品稀释混匀制成1:10的样品匀液加入生理盐水的体积，单位为毫升（mL） V2—稀释过程中吸取1：10样品匀液的体积，单位为毫升（mL）

V3—稀释过程中制成1：100的样品匀液所用生理盐水的体积，单位为毫升（mL） V—加入无菌平皿内样品匀液体积，单位为毫升（mL）

fViJfViTfV1rep — 分别表示稀释过程中所用量筒和移液管校准、温度和重复性对Vi引入的

不确定度分量

fVJfVTfVrep — 分别表示加样所用移液管校准、温度和重复性对V引入的不确定度分量 rep — 测量结果重复性引入的不确定度分量

5 不确定度分量的量化

5.1 稀释过程引入的标准不确定度u(fVX) 5.1.1 V1引入的标准不确定度u(fV1)

5.1.1.1 V1校准即（fV1J）对体积的影响u1(fV1)

检定证书标明250 ml量筒其容量允差2.0ml，假定为矩形分布，换算成标准不确定度为：

u1(fV1)?2.03?1.2ml，

5.1.1.2 温度即（fV1T）对体积影响u2(fV1)

实验温度控制在（28?3）℃，水的体积膨胀系数为2.1?10?4℃-1，因此产生的体积变化为?(V1?3?2.1?10?4)??6.3?10?4V1(ml)，假定温度变化为矩形分布，则：

u2(fV1)?6.3?10?4?225ml3?0.082ml

5.1.1.3 V1的重复性影响（fV1rep）并入到测量结果重复性rep中考虑。 将上述V1不确定度分量合成

u(fV1)?u1(fV1)?u2(fV1)?urel(fV1)?u(fV1)V1?221.2?0.08222?1.2ml

1.2225?5.3?10?3

5.1.2 V2引入的标准不确定度u(fV2)

5.1.2.1 V2校准即（fV2J）对体积的影响u1(fV2)

检定证书标明B级1 ml移液管其容量允差为0.015ml，假定其为矩形分布。

分析同V1，即： u1(fV2)?0.0153?8.7?10?3ml

5.1.2.2 温度即（fV2T）对体积影响u2(fV2)

6.3?10?4分析同V1，即: u2(fV2)??1ml3?3.6?10?4ml

5.1.2.3 V2的重复性影响(fV2rep)并入到测量结果重复性rep中考虑。 将上述V2不确定度分量合成

u(fV2)?u1(fV2)?u2(fV2)?urel(fV2)?u(fV2)V2?22(8.7?0.36)?108.7?101?322?6?8.7?10?3?3ml

?8.7?10

5.1.3 V3引入的标准不确定度u(fV3)

5.1.3.1 V3校准即（fV3J）对体积的影响u1(fV3)

检定证书标明B级10 ml分度移液管其容量允差为0.10ml，假定其为矩形分布。 分析同V1，即： u1(fV3)?0.103?0.058ml

5.1.3.2 温度即（fV3T）对体积影响u2(V3)

6.3?10?4分析同V1，即: u2(fV3)??9ml3?3.3?10?3ml

5.1.3.3 V3的重复性影响(fV3rep)并入到测量结果重复性rep中考虑。 将上述V3不确定度分量合成

u(fV3)?u1(fV3)?u2(fV3)?urel(fV3)?u(fV3)V3?220.0580.05892?0.00332?0.058ml

?6.5?10?3

将上述稀释过程VX的不确定度分量合成 urel(fVX)?urel(fV1)?urel(fV2)?urel(fV3)?222?5.32?8.7?6.522??10?6?0.012

5.2 加样体积V引入的标准不确定度u(V)