细胞工程学习指导

细胞工程学习指导 高丽萍

优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。

缺点：是操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。 液体－固体双层培养

即在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。

琼脂糖珠培养

将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50?l一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。

10、原生质体发育与植株再生

细胞壁的再生 ----原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。

只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂的阶段。

细胞分裂和生长 ------原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂。一般原生质体培养2～7 d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。

愈伤组织形成------大多数情况下原生质体培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1 mm的小愈伤组织。原生质体培养7～10天后必需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。 植株再生-----将原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。然而，越来越多的试验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。 11、影响原生质体培养的主要因素

基因型 ----较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。

原生质体的来源 ----- 供体材料体类型 向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体的培养，结果只有下胚轴原生质体培养后得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成功。

供体细胞的分化程度 ----- 同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，它们的生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以便提高原生质体的细胞分裂频率和再生能力，并且可以提高试验的重复性。 起始培养密度与培养基激素水平 ------基本起始密度 适宜密度为1×10/ml左右 12、植物细胞杂交的几个重要进展

1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；

1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种；

1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）；

1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。

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13、细胞融合的意义

理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 14、原生质体融合类型

根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。

非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合， 15、细胞核或细胞质失活的方法

用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：

物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；

化学处理目前常用的试剂有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 16、 原生质体的融合 方法

PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

电融合法 与PEG融合比较起来有三大优点： 不存在对细胞的毒害问题； 融合效率高； 融合技术操作简便。

电融合仪的结构特点： 交变电场部分 高频直流电击部分。 电融合的基本过程：

细胞膜的接触-----当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；

膜的击穿------原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

关于融合参数--------交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、 脉冲次数

17、影响原生质体融合的因素

原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件; 融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 18、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定

杂种细胞的选择系统： 外观选择：质体、细胞体积等 互补选择：抗生素、营养缺陷型等 荧光标记选择：亲本标记不同荧光

体细胞杂种的鉴定：形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 体细胞杂种的特点 ：变异幅度大，非整倍性，双亲性状的共显，性偏亲现象。 19、细胞核移植方法

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核的分离 ------ 匀浆法：将要分离的材料置于组织捣碎机中进行匀浆，加入去污剂Triton X－100以溶解细胞膜及除去其它细胞质组分，从而释放出细胞核，然后经过滤离心，即可得到较为纯净的细胞核。分离过程必须快速并在低温下进行，在分离和保存缓冲液中加入适量的镁离子和甘油有利于核膜的完整性。 从原生质体中分离细胞核时，首先要制备大量的原生质体，然后将原生质体在低渗分离缓冲液中经适当温和的机械力处理可使其裂解，再采用分步过滤和离心的方法可得到较纯净的细胞核。 细胞核的移植------ 夹层离心法：是最早用于摄入细胞核和细胞器的方法。将分离的原生质体低速离心沉于离心管管底，用同样的方法将细胞核或细胞器离心铺于原生质体层上面，如此重复多次。 PEG法

脂质体包裹融合移植 微注射

第四章 植物单倍体诱导及应用

1.植物单倍体概念

单倍体---细胞的染色体数目只有二倍体的一半。 单倍体植物---有单倍体细胞产生的植株。

单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：

体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。因此它本身在自然界没有竞争力。

2．单倍体植株的应用潜力

迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。获得育种中间材料。 与诱变育种相结合可以提高诱变频率。与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义。 作为遗传工程受体更为有效。 用作基础遗传研究的各个领域 。

3.单倍体植株诱导途径

自然发生---孤雌生殖、孤雄生殖、无融合生殖

人工诱导---用处理过的花粉授粉、远缘花粉授粉、花药培养等 4.花药及花粉培养概念

花药培养------其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养------将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。

有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。

5.花药培养的基本思路是：

终止花药的配子体发育，使之转向孢子体发育途径，由此形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植物。 6.花药培养基本程序：

外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。

草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。

7. 什么时期花粉易单倍体培养成功?

花药培养最适期是花粉有丝分裂刚发生前后或期间（单核期小孢子）。

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8.花药培养预处理

大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理、离心、高糖处理等是十分必要的。

低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。 9.花药培养中蔗糖的作用

蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。

10.花药培养中生长素的作用：

高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，同时，高浓度的生长素可能启动了花药壁等二倍体组织细胞分裂，从而抑制了花粉细胞分裂，从而增加了二倍体细胞发育的机会 11.花药培养中药壁因子作用：

Sunderland（1978）明确提出了药壁因子作用的假设，认为花药对药壁因子的接受能力在不同发育时期也不一样，当花粉接受能力最大的时期与药壁因子作用的最大时期一致时，这种植株的花药最容易被诱导。 12.花药培养中花粉发育途径有哪些。

根据Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可以把早期的花粉发育分为三类：

a.单核—正常分裂成一个生殖核、一个营养核。以后或一个生殖核发育，或一个营养核发育，或二者均等发育。

b.单核—均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。

c.异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到4核花粉发育成胚状体；Nemec在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂3次，形成类似8核胚囊的现象，称为花粉胚囊。 13. 花药培养中非单倍体出现的原因有哪些? 花药愈伤组织的多倍化－核内有丝分裂。 核融合——产生多倍体。

不正常的非单倍体花粉产生的植株。

花药壁、花丝等二倍体体细胞参与愈伤组织的形成。 愈伤组织染色体的变化。

14.单倍体植株染色体加倍方法是什么

自然加倍：发生频率低，主要是由核内有丝分裂产生的。也有花粉内营养核和生殖核二者的融合而达到加倍目的。

人工诱导加倍：用0.5%秋水仙素溶液处理植株。

使用方法：植株处理：植株用0.5%秋水仙素处理24～48h洗净后种植。 花序处理：植物倒置使花序浸入0.1%秋水仙素溶液中24～48h。 生长点处理：用0.1～0.4%秋水仙素和羊毛脂（3：2）涂抹。

从愈伤组织再生二倍体植株：用单倍体植株茎段培养使之产生愈伤组织，愈伤组织中可发现核内有丝分裂，从而造成染色体加倍。 15.花粉及小孢子分离方法

一是机械挤压梯度离心法 -----此方法是将花药消毒后，用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出来，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。

二是自然散粉法------ 这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，再除去花药壁等，将花粉重新培养在新鲜培养基上。

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