细胞工程学习指导

细胞工程学习指导

绪 论

1. 细胞工程学的概念

它是应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2.植物组织培养的含义

（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

（狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 3..植物组织培养技术的发展及意义： 1902年德国植物生理学家Haberlandt提出了“细胞的全能性”原理。 1962年Marshing和Shong发明了MS培养基. 加速无性繁殖;获取脱毒苗;

扩大变异范围：克服远缘杂交后代不育性和杂交不亲和性。通过原生质体融合获得体细胞杂种和胞质杂种。 倍性育种：通过胚乳培养获得三倍体；通过花粉和花药培养进行单倍体育种。结合诱变育种在试管内进行优良变异的诱导.选择和繁殖。

加速亲本材料的纯化。一般选育自交系需4－6代花粉培养获得单倍体植株，染色体加倍后即为纯合二倍体。 种质资源的试管保存。为基因工程的全面实施人工控制遗传方向打下基础。

第一篇 植物细胞工程

第一章 实验基本技术原理

1. 基 本 实 验 室设计

准备室 进行药品的保存、配置、消毒、分装等。器具的洗涤、干燥、消毒。 生理生化指标的测定等。要求宽敞明亮，通风条件好。

接种室 进行材料的接种。外设缓冲间—放置拖鞋.工作服.工作帽等。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。

培养室 植物材料的无菌培养。外设缓冲间—放置拖鞋.工作服等。首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。

细胞学实验室 进行培养材料的组织学.细胞学.观察照相等。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。

生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化基本设备配置验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 2.灭菌方法有哪些，各有何利弊

1.高压蒸气灭菌；2.燃烧灭菌；3.干热灭菌：易引起火灾；4.射线 灭菌：适于不耐高温材料。 培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌. 玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌. 金属器皿：干热灭菌.

细胞工程学习指导 高丽萍

接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾 3.培养基基本类型

MS---无机盐浓度高，微量元素种类齐全，养分均衡。应用最广，特别是培养再生植物。

B5---含较高硝酸盐、较低的铵盐，较高的VB1，用于细胞悬浮和原生质、葡萄、豆科植物的培养。 N6---较高硝酸盐、较低的铵盐，禾本科花药培养和柑橘类植物的花药培养。. Nitch---无机盐浓度高，

White----低盐培养基，用于生根培养。 4.培养基基本成分

水------水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95％。

原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水.如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。

无 机 盐类大量元素-----培养基的使用量一般在每升几十至几千毫克。包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S 微量元素 ------微量元素的用量一般低于10～10克分子浓度。有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co 糖----是碳源和能源，多利用蔗糖，

维生素---B1是必需的，B6、烟酸等，原生质培养含有大多数基本维生素。 氨基酸---细胞原生质培养特别需要，水解酪蛋白，

激素----细胞分裂素--BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（异戊烯酰嘌呤，生长素--2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制 琼脂 、卡拉胶-----固体培养 活性炭 -----防止外植体变褐 附加复合成分----椰子汁、酵母提取液 5. 培养基的固化剂有哪些，作用是什么?

琼脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃丝、岩棉、玻璃珠、Gala胶。 作用：束缚水分、吸收化合物 6．.常有哪些物质需过滤消毒

IAA、ZT、GA3及某些维生素、抗生素、酶、植物提取物、秋水仙素等。 7. 培养方式

固体培养---培养基中加入0.6--1.0%琼脂、卡拉胶等， 液体培养---无凝固剂，分静止、震荡悬浮培养两种 悬浮培养---成批、半成批、连续培养 单细胞培养----微室、平板、看护培养 8.外植体概念及其选择

外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料 外植体的来源----用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：

一是生长在自然环境下的植物； 二是有目的培育、在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已

经离体培养的植物。

在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体；一、二年生草本植物的离体培养比多年生植物

容易；生长季节和营养生长阶段生长启动快、分化快。

木本植物的预处理---可将成年树的芽嫁接在实生苗上，或修剪促其新枝条产生，或对亲本植株进行高水平施肥，或用细胞分裂素喷洒植株，或进行扦插繁殖等多种措施，使亲本植株部分地返回年轻状态之后，再从亲本植株上采取外植体，这些措施有可能提高成年树外植体的活力

-5

-7

2

细胞工程学习指导 高丽萍

9.防止离体培养中材料变褐的方法

对培养基的防褐有三种方法：一是在培养基中加抗坏血酸、柠檬酸或半胱氨酸；或用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；或是在培养基中加入1％的活性炭吸附褐色醌类物质；或加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化 二是减少光照强度或在黑暗条件下培养

三是将外植体不断地转移到新鲜培养基，最好的办法是外植体在瓶内转移到无褐色物质的部位。 这三种方法以第三种瓶内转移法最简便、经济(节省培养基)和有效。 10.植物材料的常规消毒步骤

1.预处理－修理。2.消毒：消毒液浸泡。3.材料内部带菌处理。 11. 植物材料内部带菌处理方法

1.茎尖分生组织培养。2.培养基中加入抗生素。 12. 外植体灭菌方法

一次消毒程序-------先将采集的植物材料用纱布或尼龙网扎紧瓶口置于流水条件下冲洗数小时。接着用70％～75％的酒精漂洗植物材料数秒至半分钟，以破坏有些植物材料蜡质化表面的张力。再用消毒剂消毒。 二次消毒程序-----即在外植体培养3d左右再行一次消毒。

灼烧法消毒------有的植物材料如胡萝卜储存根可采用，即将块根于95％酒精中浸一下，置于酒精灯上灼烧，然后去除表面层，切取无菌韧皮部接种培养。

降压法------即将植物材料与消毒液一起置于真空抽气瓶中抽气，以使消毒液渗入植物材料的表面，达到消毒的目的。

浸没法------如五针松枝条，可浸没在较低浓度的次氯酸钠(钙)消毒剂中浸泡一段时间，然后按常规消毒程序再进行一次消毒，效果也甚佳。

木本植物消毒--------在树木冬季休眠期采取休眠枝条，经灭菌后放于2-4冰箱冷藏40-50天，以破除休眠；然后取出枝条再经灭菌，放入40-50 温水中（无菌水），在温室中进行温浴2-4小时；再浸泡在含有细胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30 温室中及连续光照下催芽，当枝条长到6-8厘米是即可采取常规消毒方法取茎芽切段进行离体培养， 13.详述影响组培的因素

植物因素：基因型，植物年龄，组织和器官的年龄，植物的生理状态，取材年份及生长条件，取材部位及大小。

培养基因素：无机盐；有机化合物；植物激素；天然提取物；琼脂；PH值；渗透压；活性炭。 环境因素：光照：包括光强.光质.光周期。温度。⑶湿度。⑷气体。 14.控制组培中形态建成的激素模型 生长素与细胞分裂素的比例 15.植物激素的主要生理作用 影响培养中器官建成 16.离体培养条件及其控制

光照： 组织培养通常在散射光线下进行。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根（光照时间影响植株再生状态）

温度：在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。 对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。

3

细胞工程学习指导 高丽萍

渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。

通气： 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。

PH：通常使用的pH值范围是5.5～6.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。

第二章 细胞全能性与形态发生

1.细胞的全能性〔totipotency〕概念

指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。条件是有生命力的核和完整的膜系统。 细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应; 即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体; 动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。 2.名词解释

外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

分化〔differentiation〕：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。

再分化〔redifferentiation〕:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。 胚状体〔embroid〕:—对应于胚〔embryo〕，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。 3、脱分化细胞的特点

细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。在这些变化中，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。 4、细胞脱分化的调控机理

细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程

细胞周期蛋白（cyclin）和依赖周期蛋白激酶(CDK cyclin-dependent kinase)是两类主要的调控分子。 细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子（CKI cyclin-dependent kinase inhibitor）的负调节。

植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。 5、细胞脱分化与愈伤组织形成

细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂，

脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。

尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。

4