ELISA操作规范

ELISA操作规范

试剂配制

1．PBS：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，加蒸馏水定容至1000mL。 2．洗液：PBST，PBS中加入吐温-20至浓度为0.05%（V/V）。

3．包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）：Na2CO3 0.159g，NaHCO3 0.294g，加蒸馏水定容至100mL。

4．封阻液：加包被液或者上述PBS溶液配置1%明胶，微波加热融化，待至未

完全冷却时使用（牛奶组用）。

包被液配置5%的脱脂乳溶液（非牛奶组用）。 5．底物缓冲液：

A液（0.1mol/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7.H2O）2.101g，加蒸馏水定容至100mL。

B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO.12H2O 7.160g，加蒸馏水定容至100mL。

用前将A液、B液、超纯水按3.645:3.855:7.500的体积比混合，用该混合液配制0.4mg/mL OPD溶液，然后加入H2O2使其在OPD溶液中的终浓度为1μL/mL（按加入H2O2μL数=OPD毫克数计算即可）。 6．终止液：2mol/L H2SO4。

方正滴定

1. 用包被液将抗原稀释为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μg/ mL，每个稀释度一行。二抗作1∶3000、1∶5000、1:8000，1∶10000、1∶20000，每一稀释度一列，抗血清为1∶200稀释度的第2次免疫后血清（以上各值仅作参考，可根据实际实验情况进行调整）。

2．包被：包被缓冲液稀释抗原至上述设定浓度后加到96孔酶标板上，每孔100μL，4℃过夜。

3．洗涤：用PBST洗涤三次，每次 5min，扣干。

4．封阻：用含1%明胶（脱脂乳）封阻，每孔250μL，37℃保温保湿1h，PBST洗涤三次。

5．一抗：将稀释后的抗血清加到板孔中，100μL/孔，同时设阴性（免疫前血清）和空白对照，37℃孵育lh，PBST洗涤三次。

6．二抗：加入稀释后的HRP标记的羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃孵育lh，PBST洗涤三次。

7．显色：每孔加入100μl新鲜配制的显色液，37℃避光反应15min。 8．每孔加入50μL2mol/L H2SO4终止反应。 9．490nm处比色。

10．效价计算：以P/N＞2，且P＞0.2时抗血清的最大稀释倍数为抗血清效价，其中P为阳性血清的OD490，N为阴性血清的OD490。

间接ELISA

l．包被：包被缓冲液稀释抗原至某浓度（此浓度采用方正滴定结果）加到96孔酶标板上，每孔100μL，4℃放置过夜。

2．洗涤：用PBST洗涤三次，每次 5min，扣干。

3．封阻：用1%明胶溶液（脱脂乳）封阻，每孔250μl，37℃保温保湿1h，PBST洗涤三次。

4．一抗：将不同稀释度的抗血清加到板孔中，100μL/孔，同时设阴性（免疫前血清）和空白对照，37℃孵育lh，涤PBST洗三次（从此开始需严格注意拍板时勤换纸，不可在已拍过的位置继续扣板以避免交叉污染）。

5．二抗：某稀释度（此稀释度采用方正滴定结果）稀释HRP标记的羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃孵育lh，PBST洗涤三次。

6．显色：每孔加入100μL现配制的显色液，37℃避光反应15min。 7．每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应。 8．490nm处比色。

9．效价计算：以P/N＞2，且P＞0.2时抗血清的最大稀释倍数为抗血清效价，其中P为阳性血清的OD490，N为阴性血清的OD490。

2010.10