第7章免疫与血清学基本技术

第七章免疫与血清学基本技术

第一节免疫学基本知识

一、抗原

抗原是指能与T细胞及B细胞的受体结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质。

抗原一般具有两个重要特性：

一是免疫原性，即抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力； 二是抗原性，即抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合的能力。

既有免疫源性又有抗原性的物质为完全抗原，而只有抗原性无免疫源性的物质称为半抗原。 决定Ag特异性的最小化学亚单位称为决定簇（又称表位）。

依其与胸腺关系又分胸腺依赖抗原（TD-Ag）和胸腺非依赖抗原（TI-Ag）。 绝大多数蛋白质抗原如病原微生物、血细胞、血清蛋白等均属于TD-Ag。

抗原的免疫源性是异物性，抗原的特异性是免疫应答中最重要的特点，也是免疫学诊断和免疫学防治的理论依据。

人类血型抗原有A和B抗原，它们刺激机体产生抗A和抗B抗体。 人类血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间的遗传标记不同）。 器官移植所产生的排异反应，也是因同种异型抗原所致。

佐剂在免疫中常常采用，它主要的机制是增强机体对Ag的免疫应答。

二、抗体

抗体是抗原刺激机体由B细胞产生的，本质是免疫球蛋白（Ig）。 Ig的基本结构是：

4条肽链（2条轻链-L链、2条重链-H链）由二硫键连接。 L链分为可变部位（V）和恒定部分（C），即VL+CL。 H链也分为可变部位（V）和恒定部分（C），即VH+CH，但CH部分又分为CH1、CH2、CH3。IgM和IgE还有CH4部分。

CH1与CH2区之间为绞链区。

如果用木瓜酶水解后，将IgG水解2Fab和Fc。Fab是Ig与Ag结合部位，Fc是可结晶部分。 用胃蛋白酶水解IgG，可分为F(ab?)2和Fc部分，F(ab?)2是两个Fab连在一起的部分。 Ig的分类是依据H链的结构特点，主要依Fc部分（CH）。Ig分为五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。Ig同种型是指H链所具有的的特性。

同一类Ig分型依据L链结构特点，可分为κ和λ型。Ig的Fc段部分可与某些细胞的Fc受体结合，如巨噬细胞等。

F(ab?)2部分是与Ag结合部，VH+VL是F(ab?)2中的高变区，直接与Ag能结合的部位。 人类5种Ig各具特色，IgM分子量最大，免疫应答早期产生的Ab只要为IgM。 IgG在血清中含量最高，而且是唯一能通过人类胎盘的Ig。 IgA经J链连接，可形成多聚IgA。

多聚IgA与分泌片结合后，能抵抗蛋白酶的水解作用。 有人称具备局部Ab。IgE可与肥大细胞膜上Fc受体结合。

三、抗原抗体反应

每一种抗原物质都能在具有免疫功能的机体中遇到与其相应的免疫细胞，结合在其表面受体上，激发产生相应的抗体，并且能够与这种抗体特异性地结合。

抗原与抗体的结合为非共价结合。

其分子空间结构的互补性，决定了结合部位原子间的接近程度，使各种弱作用键充分发挥作用，形成

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相对稳定的结合。

在机体内，抗原和抗体的结合导致补体激活，最终引起杀细胞或杀菌作用；或者结合于吞噬细胞表面的受体，引起对细菌或异物的吞噬作用。

抗原与抗体的结合使特异性的，这种性质构成了各种免疫学测定的基础；同时，这种结合反应只是相对稳固的，可以利用洗脱的方法将它们重新分离而不损害其活性，这种方法可以用于抗原或抗体的提纯。

四、补体（C）

存在于人和动物血清中，不耐热，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用，由于这种成分是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，这种物质称为补体。

补体由9种成分，11种蛋白组成：C1（q、r、s）、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。它们对温度很敏感，易被破坏。

补体系统包括补体及D、P、B等因子，约有20种成分。 补体激活有两个途径：

传统途径（第一途径）和旁路途径（第二途径）。 第一途径可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化。

活化顺序是：C1、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9。 第二途径可被细菌的脂多糖激活。

补体的激活是一种酶促级连反应：第一种成分激活后，称为一种有活性的酶，催化下一种成分转化为具有生物活性的物质（蛋白酶或炎症诱导成分）。

补体的最后3种成分将聚合成为“终末复合物”，其本身或在抗体的帮助下插入细菌外膜，导致细菌死亡。

五、免疫系统 1、免疫组织器官

（1）中苏免疫器官：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）

（2）周围免疫器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统。 2、免疫细胞

干细胞、淋巴细胞系（TH、TC、TS、TDH、BC浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等。

单核细胞及巨噬细胞产生IL-1。 3、免疫分子

TCR、BCR、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-1、IL-2??）

六、各免疫细胞特点 1、T细胞

可分为几群，其中TH细胞是很重要的免疫细胞，CD4+可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化进行有丝分裂，帮助产生抗体，司管细胞免疫。

TS细胞是抑制细胞，CD8+参加免疫调节。 TC是细胞毒细胞。

TH细胞成熟需要胸腺加工处理。 T细胞定位于淋巴结副皮质区。 2、B细胞

B淋巴细胞主管体液免疫调节。 表面有抗原受体（SMIg）。

BC成熟在骨髓中（相当禽类法氏囊）。

未成熟BC最初可查到Ig的μ链，活化BC可衍变成浆细胞，浆细胞能产生Ab和分泌Ab。 PWM可以刺激BC有丝分裂。

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人类外周血中T细胞与B细胞比为2：1。 3、单核类细胞

无Ag受体，但不能处理Ag，加工Ag，并向T细胞呈递Ag。

七、过敏反应（变态反应） 国际公认的过敏反应是4个型： Ⅰ型（速发型）、Ⅱ型（溶细胞型）、Ⅲ型（免疫复合物型或称血管炎型）、Ⅳ型（迟发型）。

第Ⅰ型是由IgE抗体所致，IgE与肥大细胞的IgE的Fc受体结合产生一系列变化，出现Ⅰ型过敏。 如青霉素过敏（皮内注射过敏原）。

患有慢性寄生虫感染疾患；IgE抗体升高显著。

第Ⅳ型过敏反应是由T细胞中TDH细胞释放淋巴因子所致。 如结核菌素过敏试验（皮内直射过敏原）

第Ⅱ型、Ⅲ型过敏系由IgM、IgG抗体及补体参与介导。

第二节抗体检测

一、抗体检测的基本原理

抗原与抗体之间特异性的结合反应，是免疫学检测的基础，既抗原使用已知抗原来检测抗体，也可以使用一直抗体来检测抗原。

抗原与抗体虽然都是大分子物质，但单分子的抗原与抗体反应仍然是肉眼无法觉察的反应。

要检测抗体的存在，就必须建立一中显示系统，将看不见的抗原-抗体反应，转化为抗原看见、或者可以测定的反应。

抗体测定抗原使用许多种不同的方法，本质上浙西而方法只有显示系统的误差。 不同的方法可以显示出不同量的抗原-抗体反应，因而，抗体检测的方法主要决定了抗体检测的灵敏度。 检测抗体必须使用已知的抗原，抗原可能是混杂的物质。

因而，在抗体测定中使用的抗原种类，主要决定了抗体检测的特异性。

二、抗体检测方法 (一）中和反应

中和反应不仅测定抗体是否存在，而且测定抗体是否具有免疫保护作用，因而，尽管这种方法复杂、费时，影响因素众多而且不稳定，在预防医学领域特别是病毒性疾病中，仍然是不可区带的抗体检测方法。

中和试验的基本方法是，将待检物质与活的致病微生物混合，感染实验动物或敏感的细胞，然后观察实验动物是否发病、死亡、或细胞是否发生病变。

早期中和试验主要利用疾病的动物模型进行，目前，在病毒性疾病领域，通常利用培养病毒的细胞进行。

在结果的解释中应当注意，细胞的中和试验通常只反映抗体阻断病毒进入细胞的能力，这只是病毒致病过程中的一小部分。

（二）沉淀反应

血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物，这类反应称为沉淀反应。

该类反应可检测到20~2mg/mL水平的抗体。较常用的检测方法有： 1、单项免疫扩散

将一定量抑制抗原混于琼脂中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗体加入孔中扩散，抗原抗体在扩散过程形成以抗体孔为中心的沉淀环，可用于检测血清中的IgG、IgM、IgA和补体C3等含量。

2、双相免疫扩散

将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。可用于抗体的定性、定量检测。

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（三）凝集反应

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应，该类反应可检测到1μg/mL。

1、直接凝集

将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌或红细胞凝集现象。 检测方法有两种：

①是玻片凝集试验，用于定性测抗原，多用于快速诊断；

②是试管凝集试验，在试管种系列稀释待检血清，加入已知颗粒抗原（死菌或活菌，多用死菌），进行的血清反应，用于定量检测抗体。

温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个小时再判断为宜，判定凝集滴度以凝集程度为++而定。 2、间接凝集

将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集的现象。 如用γ球蛋白包被的乳胶颗粒，检测病人血清中的一种抗γ球蛋白的抗体（类风湿因子） （四）补体参加的反应

利用抗体与红细胞上的抗原结合，激活反应体系中的补体，导致红细胞的溶解，用溶血现象作为指示系统帮助结果判定。

常用的方法有补体结合试验和溶血空斑试验。 （五）用标记抗原进行的抗原抗体反应

利用荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗原或抗体，进行的抗原抗体反应。 灵敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等优点。 1、免疫荧光

将已知细菌、感染病毒的细胞等颗粒抗原等固定于载玻片，加待检血清反应后，再加荧光素标记的抗体，置荧光显微镜下观察判定，用于检测抗体。

2、酶免疫测定

是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。

可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗体的含量，敏感度可达ng/mL甚至pg/mL。

常用语标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。 常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）。或采用双抗体夹心法或间接法检测特异抗体。 3、放射免疫测定法

用放射性的核素（125I和131I）标记抗原，检测抗体，灵敏度达pg/mL。 4、免疫印迹法

将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳区分的蛋白质抗原转移至NC或PVDF等膜上。 检测特异的抗体。用该法检测血清HIV抗体为诊断HIV感染的方法之一。

三、抗体检测所使用的抗原

病原微生物，无论是细菌还是病毒，都含有许多种抗原物质，在感染过程中，会形成反应性非常复杂的抗体。

这些抗原的特异性很不相同，有的只存在于该种致病微生物中，也有的可能是在细菌或病毒中广泛存在时，甚至可以和动物以至人体的组织产生交叉反应。

因此，我们在衡量一项抗体检测的结果时，不仅需要考虑所采用的方法和滴度的高低，还必须考虑用于检测的是那一种类型的抗原。

1、全菌或全病毒抗原

最早的血清学反应，就是将细菌或病毒直接杀死后作为抗原进行的。 目前，这种类型的抗原在一些疾病，几种类型的试验方法如细菌凝集试验或免疫荧光检测中仍在应用。 由于这种类型的抗原物质中成分复杂，很难避免交叉反应，在用作疾病诊断时，必须结合临床症状并对结果判定有较严格的限制。

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