实验常用培养基、方法

常用培养基

LB培养基 配 方 Typtone 1% Yeast extract 0.5% NaCl

1%

Amp选择培养基加量：50μg/mL Amp。 YPD培养基 配 方 Typtone 2% Yeast extract 1% D-glucose 2% 半乳糖培养基 Typtone 2% Yeast extract 1% D-galactose

2%

抗性培养基抗生素加量： G418：350 μg/ml；5-FOA培养基的配置（100mL）

① 50mL 5-FOA-YNB培养基（过滤除菌） 50mL 5-FOA 125mg Ura 5mg YNB 170mg 硫酸铵 0.5g 脯氨酸 100mg 葡萄糖 2g H2O

50mL

② 50mL琼脂溶液（高压灭菌）

称取2.0g琼脂粉，加入50mL水，高压灭菌。

Zeocin：150 μg/ml 常用实验方法

酵母电转化方法：

（1） 酵母于YPD平板上活化后，接种3mLYPD液体培养基，30℃ 200r/min培养8h左右。 （2） 取0.1mL种子液转接至30mL新鲜的YPD液体培养基，30℃ 100r/min继续培养10h

左右，至菌液OD600在1.2~1.5之间。

（3） 6000r/min 4℃ 离心5min收集菌体，用20mL无菌水离心洗涤菌体1次。

（4） 用15~20mLDTT溶液重悬菌体，30℃水浴放置60min，6000r/min 4℃ 离心5min收集

菌体。

（5） 用20mL 4℃预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，6000r/min 4℃ 离心5min洗涤菌体。 （6） 重复步骤（5）三次，共四次。

（7） 用1mL 1M山梨醇重悬菌体，转移至1.5mL离心管，离心后收集菌体，加入与菌体近

似等体积的1M山梨醇重悬菌体。

（8） 每个转化取80μL菌液，加入10μL转化片段或质粒，20μL鲑鱼精DNA，混匀后转入

电击杯，冰上放置5min后，1.5kv电击。

（9） 加入0.9mL含山梨醇的YPD培养基将电转液洗出，30℃ 100r/min复苏2h。 （10）将菌液离心后弃上清，用1M山梨醇洗涤一次，用与菌体近似等体积的1M山梨醇重

悬菌体，取100μL菌液涂布选择性培养基平板，30℃培养至菌落长出。

酵母基因组快速分离方法：

（1） 取1mL30℃，200rpm过夜活化的菌液，10000rpm离心1min，弃上清； （2） 0.5mL无菌水重悬菌体，离心弃上清；

（3） 加入0.2mL破菌缓冲液，与菌体等体积的玻璃珠和0.2mL酚/氯仿，涡旋振荡5min； （4） 加入0.2mLTE Buffer，快速振荡，高速离心5min；

（5） 吸取上清转移至新的离心管，加入0.2mL酚/氯仿，重复抽提至无中间沉淀相； （6） 加入1mL无水乙醇，颠倒混匀；

（7） 12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用50μL TE缓冲液或水溶解；

T克隆实验安排表

T-cloning experiments schedule实验内容 1）将大肠杆菌JM109接入LB液体培养基中，180r/min，37℃培养过夜（10h） 2）按1:100的比例将培养一天的大肠杆菌接入另一个LB液体培养基中，180r/min，37℃培养2-3h 3）取1mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴15min，10000r/min，4℃，离心1min 4）去掉上清液，加入1000μL 0.1mol/L CaCl2，用移液枪将菌体吹起混匀，冰浴15min后，10000r/min，4℃，离心1min 5）重复步骤4的操作 6）去掉上清液，加入100μL 0.1mol/L CaCl2，用移液枪将菌体吹起混匀，冰浴，第二天备用 7）在微量离心管中配制下列溶液，全量为5μL pMD18-T Simple Vector 0.5μL PCR产物 4.5μL（提前将PCR实验完成，） 8）加入5μL的Solution Ⅰ 9）16℃水浴锅反应4h-16h 10）将微量离心管中反应结束的溶液加入至100μLJM109感受态细胞中，冰浴30min 11）42℃加热90s，再冰浴3-5min 12）加入890μLLB液体培养基，37℃,150r/min振荡培养1h 13）培养结束后，10000 r/min离心1min，倒掉大部分上清液，剩余100-200μL悬浮菌液，涂布在含有Amp(终浓度50μg/mL,母液0.05g/mL)的LB固体培养基上，37℃培养箱12h左右 14）将转化后平板上长出的白色单菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养 15）取培养3h的培养物1μL作为PCR反应的模板，PCR反应引物及反应程序见前所述 16）PCR反应结束后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，排除其中的假阳性克隆 17）送样至生工测序部，并备份保藏