免疫荧光步骤

最近按丁香园的帖子进行免疫细胞化学染色，结果出来了。总结如下：

1. 上午做的爬片晾到下午开始染色 2. PBS浸洗爬片3遍，每遍5分钟

3. 用0.1%的柠檬酸钠配制0.3%Triton-X100， 0.1%柠檬酸钠：0.1g柠檬酸钠+100ml蒸馏水

0.3%Triton-X100：30% Triton-X100 1ml + 99ml0.1%柠檬酸钠。 4. 将0.3% Triton-X100放入修复盒中，将盒置入冰盒中，将爬片放入修复盒中孵育30分钟 5. PBS浸洗爬片3次，每次5分钟

6. 取出爬片，将PBS甩掉，擦净细胞周围的PBS，保持爬片上少量液体，但不能干片，擦一张爬片滴一张爬片，滴加0. 3%双氧水，孵育10分钟， 7. PBS浸洗3遍，

8. 取出爬片，将PBS甩掉，擦净细胞周围的PBS，保持爬片上少量液体，但不能干片，擦一张爬片滴一张爬片，滴加封闭血清，孵育15分钟

9. 甩掉封闭血清，吸水纸吸去爬片周围残留血清，滴加PBS稀释的一抗，保持液体集聚在爬片上而不外流，入湿盒中置4度冰箱孵育过夜，约16小时

10. 第二日取出湿盒置室温45分钟， 11. PBS浸洗3遍×5分钟

12. 取出爬片，将PBS甩掉，擦净细胞周围的PBS，保持爬片上少量液体，但不能干片，擦一张爬片滴一张爬片，滴加二抗，孵育20分钟

13. PBS浸洗3遍×5分钟

14. 取出爬片，将PBS甩掉，擦净细胞周围的PBS，保持爬片上少量液体，但不能干片，擦一张爬片滴一张爬片，滴加试剂C，孵育20分钟

15. PBS浸洗3遍×5分钟

16. 配制DAB显色液，1：20，先加蒸馏水，再加A液，摇匀后加B液，C液，摇匀，避光

17. 取出爬片，将PBS甩掉，擦净细胞周围的PBS，保持爬片上少量液体，但不能干片，擦一张爬片滴一张爬片，滴加DAB，10分钟左右显色。

18。自来水洗切片，苏木素复染，固定，透明，封片。

第十一节细胞免疫荧光

1)在六孔板中接种合适密度的细胞;

2)提前将PBS放入4°C冰箱预冷,用预冷的PBS清洗细胞,洗三次以去掉残留的死细胞;

3)提前将无水甲醇放在-20°C冰箱里预冷,向空中加入预冷的无水甲醇以穿透固定细胞,在-20°C冰箱里放置15niin;

4)用枪头移去孔中的无水甲醇,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin;

5)向六孔板的每个孔中加入100^il的5%山羊血清对细胞封闭,室温放置Ih;

6)封闭结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin; 7)向六孔板的每个孔中加入80nl稀释好的一抗抗体,放入4°C冰箱过夜孵育;

8) 一抗孵育结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin; 9)向六孔板的每个孔中加入80^1稀释好的二抗抗体,用锡纸包住六孔板避光孵育Ih;

10) 二抗孵育结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin; 11)向空中滴加DAPI稀释液(1:1000稀释),室温放置l-2min; 12)向孔中滴加TBST清洗细胞,5min; 13)用荧光封片剂进行封片;

14)在倒置突光显微镜下观察细胞,调节到适当视野照相。