毕业论文

Construction of microRNA-125b overexpression

vector in mouse

Abstract

Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzymes for Nhe I and EcoR I. After being confirmed by PCR amplification, the target fragment and pcDNA3.1-EGFP plasmid were identified by double digestion., and connected using T4 DNA ligase. Then, it was transformed in DH5α competent cells. Finally, the recombinant plasmid were picked, and identified by double digestion, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results miR-125b precursor sequence was successfully inserted into pcDNA3.1-EGFP plasmid by identification of DNA sequencing. Conclusion The eukaryotic expression vector of mouse miR-125b has been successfully constructed, which provides a foundation for further studying the mechanism of tau phosphorylation regulated by miR-125b in Niemann-Pick type C1 disease.

Key words:

microRNA-125b, pcDNA3.1-EGFP, Overexpression vector

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一、前言

microRNA（miRNA，微小RNA）是一类长约20-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，进化上具有高度保守性，广泛存在于真核生物中。成熟miRNA能够与靶基因3′UTR以完全互补或不完全互补的形式结合，诱导靶mRNA降解或抑制蛋白翻译，导致相应蛋白质合成缺失或减少，从而在转录水平、转录后水平、表观遗传水平等调控基因表达，参与生命过程中一系列的重要进程[1]。到目前为止，在人类和小鼠中分别发现超过1000和750种miRNA，其中一些主要在大脑中表达[2-4]，人类有接近1/3的基因受到miRNA的调控[5]。近年来的大量研究表明，miRNA的异常表达广泛参与了肿瘤、心血管疾病和糖尿病等重大疾病的发生与发展。同时，miRNA也参与了神经系统生长发育和生理功能的调控，其表达异常与神经退行性疾病的发生发展相关[6]。

C1型尼曼-匹克病（Niemann-Pick disease type C1, NPC1）是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释[7,8]。研究表明，tau蛋白和Aβ（Amyloid beta，β-淀粉样蛋白）在神经退行性病变中紧密联系，存在协同作用。tau蛋白在调节轴突运输功能的同时，亦参与Aβ的致病机制，加剧Aβ导致的神经元毒性、微管丢失、神经炎症变化等，进而导致神经变性和学习记忆障碍，揭示tau蛋白在神经元细胞变性的发生发展中起重要作用

[9,10]

。目前，虽然对tau蛋白参与神经退行性疾病的具体机理尚不明确，但已证实，抑

制神经元tau蛋白过度磷酸化可以有效缓解神经退行性病变的发生和发展[11]。

miRNA对tau蛋白磷酸化的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的表达来调控tau蛋白磷酸化水平。miR-125b在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中的发病机理是促进tau蛋白过度磷酸化。miR-125b超表达会引起tau蛋白过度磷酸化，分别上调蛋白激酶p35、cdk5和p44/42-MAPK和下调蛋白磷酸酯酶DUSP6、PPP1CA及抗凋亡因子Bcl-W的表达。抑制蛋白磷酸酯酶的表达会导致tau蛋白过度磷酸化，超表达PPP1CA和Bcl-W会阻止miR-125b引起的过度磷酸化，证实蛋白磷酸酯酶可以调节miR-125b对tau蛋白的影响。然而，抑制神经元中miR-125b的表达会降低tau蛋白过度磷酸化和蛋白激酶活性。另外，在小鼠海马内注射miR-125b会损害联想学习以及下调DUSP6、PPP1CA和Bcl-W表达，并增强tau蛋白过度磷酸

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化[12]。

本研究构建了小鼠miR-125b的真核过表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。

二、材料与方法

2.1 材料

BALB/c小鼠、大肠杆菌DH5α感受态细胞、pcDNA3.1-EGFP质粒均由实验室保存。

2.2主要试剂与仪器

2.2.1主要试剂

PurePlasmid Mini Kit、2×Es Taq MsterMix（康为世纪）、DNA Fragment Purification kit（TaKaRa）、10×quick cut Buffer、10×quick cut Green Buffer、QuickCutTM Nhe I、QuickCutTM EcoR I、ddH2O、10×T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer、LB液体培养基、LB固体培养基、DNA Marker 2000bp、水合氯醛、琼脂糖、EB。 2.2.2主要仪器

本研究所用主要仪器的名称和生产厂家见表1。

表1 主要实验仪器

仪器 96孔梯度PCR仪 水浴锅 高压灭菌锅 恒温摇菌摇床

台式高速冷冻离心机

Nanodrop 2000分光光度计 单人双面净化作台 电子天平 电泳仪

凝胶成像系统 10μl微量移液枪 100μl微量移液枪 1000μl微量移液枪 电热恒温培养箱 气浴恒温振荡器 低温恒温槽

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生产厂家 ABI公司

北京光明医疗仪器有限公司 上海申安医疗器械场 江苏海门其林医用仪器厂

SIGMA Thermo

苏州净化设备有限公司

上海精天电子 北京市六一仪器厂

Uvitec公司 Eppendorf Eppendorf Eppendorf

北京中兴伟业仪器有限公司 上海比朗仪器有限公司 上海平轩科学仪器有限公司

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2.3 方法

2.3.1质粒提取

1、将3ml的pcDNA3.1-EGFP菌液加入到1.5ml离心管中，6000rpm离心5min，弃上清。

2、向沉淀中加入250μl Buffer P1（已加入RNase A），悬浮沉淀。

3、向离心管中加入250μl Buffer P2，缓慢的上下颠倒混匀，直到溶液变得清亮粘稠。 4、其后加入350μl Buffer N3，温和的上下颠倒，直至出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心15min。

5、离心后的产物弃上清，移入已装收集管的吸附柱中12000rpm离心1min，弃废液。随后加入500μl Buffer PB 12000rpm离心1min，再加入750μl Buffer PW12000rpm离心1min，弃废液，室温晾干，吸附柱至于新的离心管中，向膜上加入100μl Buffer EB，放置3min 12000rpm离心1min。 6、1%的胶进行电泳。 2.3.2鼠尾基因组DNA提取

1、取5mm鼠尾切成小块置于1.5ml离心管中，加入180μl Buffer GTL。 2、向离心管中加入20μl Proteinase K，振荡使样品彻底混匀。

3、向离心管中加入200μl BufferGL，振荡充分混匀，加入200μl无水乙醇，振荡充分混匀。

4、将上一步溶液全部加入已放入Collection Tube的Spin Column DM中，8000rpm离心1min，弃废液。

5、向Spin Column DM中加入500μl已加入无水乙醇的Buffer GW1，8000rpm离心1min，弃废液。

6、向Spin Column DM中加入500μl已加入无水乙醇的Buffer GW2，14000rpm离心1min，弃废液。

7、12000rpm离心1min，置于室温放置数分钟彻底晾干吸附材料中残余的BufferGW2。 8、将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间悬空加入200μl灭菌水。 9、室温放置5min，8000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。

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