分子生物学教案

结构的机会减少，C形成终止结构的机会增多，RNA聚合酶终止转录的的几率增加，于是转录减弱。如果当其他氨基酸短缺(注意：短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于A和C发夹结构的形成，于是RNA聚合酶停止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量 ”。

由此可见，先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用，这段序列就称为衰减子attenuator)。在trp操纵元中，对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。

第二节 翻译水平的调控

一、 反义RNA的调控作用

反义RNA通过与特定的mRNA结合，结合位点通常是mRNA上的SD序列及N端的密码子，从而抑制mRNA的翻译。

二、 mRNA自身的二级结构影响翻译过程

终止子、衰减子和反义RNA 都是mRNA通过二级结构的改变在不同水平上对基因表达进行调控。除此之外，mRNA自身的二级结构还能影响核糖体的结合以及mRNA的寿命从而影响翻译。

三、 蛋白质合成的自体调控 四、 严谨反应

细菌处于极差的生长条件下，由于缺乏足够的氨基酸，蛋白质合成受到抑制，因而会关闭大量的代谢过程，这就是应急反应(Stringent response) 或应急调控。

第九章 真核生物基因表达调控

教学目的：让学生理解真核生物基因表达调控的复杂性，并掌握在各水平上的调控机制。 教学重点、难点：染色质结构对基因转录的影响；转录水平的调控。 课时安排：6学时 教学内容：

尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。

第一节真核生物基因调控的特点

一、真核基因表达调控的环节更多

如前所述，基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。

真核细胞在分化过程中会发生基因重排(gene rearrangement)，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化，与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。

此外，真核细胞中还会发生基因扩增(gene amplification)，即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA区段扩增40-100倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。

真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中NA

1、染色质结构影响基因转录

细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，其中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因

2、组蛋白的作用

早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋

发现核小体后，进一步观察核小体结构与基因转录的关系，发现活跃转录的染色质区段，有富含赖氨酸的组蛋白(H1组蛋白)水平降低，H2A·H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化(acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3组蛋白巯基化等现象，这些都是核小体不稳定或解体的因素或指征。转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构。这些都表明核小体结构影响基

3、转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加

染色质DNA受DNase Ⅰ作用通常会被降解成100、400……bp的片段，反映了完整的核小体规则的重复结构。但活跃进行转录的染色质区域受DNase Ⅰ消化常出现100－200bp的DNA片段，且长短不均一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNase Ⅰ高敏感点(hypersensitive site)。这种高敏感点常出现在转录基因的5′侧区(5′ flanking region)、3′末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控蛋白

4、DNA拓扑结构变化

天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA

5、DNA碱基修饰变化

真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5'侧区的CpG序列中，实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡，可见DNA

由此可见，染色质中的基因转录前先要有一个被激活的过程，但目前对激活机制还缺乏认识。

真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多

种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。

第二节 真核基因转录水平的调控

真核细胞的三种RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能转录生成mRNA，以下主要讨论RNA聚合酶Ⅱ的转录调控。

一、顺式作用元件(cis－acting elements)

真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)；近年又发现起负性调控作用的元件如沉默子(silencer)

1、启动子

与原核启动子的含义相同，是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列。但真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用，不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同启动子序列也很不相同，要比原核更复杂、序列也更长。真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100－200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7－30bp。

启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件(core promoter element)和上游启动子元件(upstream promoter element) （见第五章）。

2、增强子

增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100－200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8－12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：

1）增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离1－4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

2）增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动

3）增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强