分子生物学教案

子一旦与－10区结合以后，就从识别位点上解离下来。此外，－35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。。

在－35区和－10区之间的碱基序列不特别重要，但是这两个序列之间的距离却十分重要，是决定启动子强度的因素之一大多为15 bp～20 bp。

二、真核生物启动子的结构

有三种类型的启动子，其中Ⅱ类启动子最为复杂。

Ⅱ类启动子由核心元件（core element）和上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点。mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成。TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位点的上游-25左右，相当于原核的-10序列。 上游元件包括CAAT box、GC box、等。如CAAT box一般位于上游-75bp左右，紧靠-80，其功能是控制转录起始活性。 远端调控区较常见的是增强子。

启动子Ⅲ位于起始位点的下游的转录区内，因此称为下游启动子（downstream promoter）或基因内启动子（intragenenic promoter）。转录需要转录因子TFⅢA、B和C的参与。

三、鉴定启动子的方法

1、足迹法：是一种测定ＤＮＡ结合蛋白在ＤＮＡ上的结合位点的实验方法，其根据是ＤＮＡ的这些区域在结合有蛋白质时可被保护而免受核酸内切酶的作用．酶切后产生片段与对照的酶切片段经凝胶电泳分离后进行比较，即找出ＤＮＡ与蛋白质结合的位点。

2、缺失分析和点突变：对以上所获得的DNA与蛋白质结合的位点进一步做缺失分析和点突变。

第三节 转录的过程

一、转录起始

转录是从DNA分子的特定部位开始的，这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部信这就是启动子。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢？显然启动子处的核苷酸序列具有特殊性，为了方便，人们将在DNA上开始转录的第一个碱基定为+1，沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。

在原核生物中，当RNA聚合酶的δ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。由于全酶分子较大，其另一端可在到-10区的序列，

在某种作用下，整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合，在此处发生局部DNA12-17r 的解链形成全酶和启动子的开放性复合物。在开放性启动子复合物中起始位点和延长位点被相应的核苷酸前体充满，在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酸键。RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见，此时δ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的δ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。

真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，已经知道，在所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基因由RNA聚合酶Ⅱ负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类；第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有至成一组复合物叫做转录因子ⅡD。TFⅡD再与RNA聚合酶Ⅱ结合完成转录起始复合物的形成。除TFⅡD以外，在细胞核提取物中还发现TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。从中也不难看出真核细胞中基因转录的起始是基因的表达调控的关键，这么多蛋白质分子之间相互作用，以及这些蛋白质分子DNA调控无件相结合，构成控制基因转录开始的复杂体系。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。

二、转录延伸

RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一个GTP的核糖3'-OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3'-OH游离，这样就可按模板DNA的指引，一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方面也是5'→3'。由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系，所以RNA聚合酶是沿着DNA链3'→5'方向移动。整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续下断的反应，转录本RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNA·RNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一个转录泡（见图）。

转录速度大允是每秒钟30-50个核苷酸，但并不是以恒定速度进行的。 三、转录终止

提供终止信号的序列称为终止子（terminator）。内源性终止子的回文结构中富含GC，且回文结构的下游有连续6～8个AT碱基对；弱终止子有回文结构，但不具有强终止子的两点特征，需要依赖于ρ因子实现终止作用。

ρ因子（终止因子） ：是协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子，属于ATP依赖的解旋酶家族，具有一个RNA结合域和ATP水解域。

第四节 转录后加工

转录后加工是指将各种前体RNA分子加工成各种成熟RNA的过程。 一、真核生物mRNA的5?Cap

真核生物细胞mRNA的5 ￠端加帽是在鸟苷转移酶的催化下通过5?－ 5?键把一个G加到转录物的末端碱基形成的，随后，进行甲基化产生Cap0，Cap1，Cap2。

5?帽子的生物学功能：在翻译过程中起识别作用以及对mRNA起稳定作用。 二、真核生物mRNA的3?Tail

有这种特征的mRNA 称为poly(A)+，不具有的称为poly(A)－。 mRNA 3?端的多聚A是由poly(A) 聚合酶所催化添加的。注意：多聚A尾巴不是添加在转录终止的3?端。

三、RNA的拼接

内含子剪接和剪切（clearvage）是mRNA转录后加工中最为复杂的一环，也是近年来发展很快的研究领域之一。不同内含子的剪切和剪接，其机制，类型和酶都不完全相同，现分述如下。

1、Ⅰ类内含子的结构特点是：①其边界序列为5′ U↓…… G↓3′（↓表示剪切位点）；②具有中部核心结构（Central core strucature）。③具有内部引导序列（internal guide sequence IGS）。

首先是GTP进入G结合位点，左边外显子的3′端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3′-OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合到内含子的5′末端，被切下的5′外显子仍保持在底物位点上，并未游离。第二步内含子的G414（即3′交界序列上的G）又进入了G-结合位点，切下的外显子的3′-OH又对G-结合位点上的G与3′外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其3′-OH和3′外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来，这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。第三步，内含子5′端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对，进入底物位点。仍然留在G结合位点上的G414其3′-OH再作用底物位点上的序列，

切下19nt的内含子5′端，并和余下内含子的5′-P形成二酯键，形成414nt的环状内含子。

2、Ⅱ型内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。Ⅱ类内含子的剪接和I类内含子不同。

结构特点是列为5′↓GUGCG……YnAG↓，符合GT-AG法则，在内含子的近3′端具有分支点顺序（branch-point seguence），内部具有二级结构。

II型内含子的剪切无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。首先是分枝点A的2′-OH对5′端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻（图13-28）切下外显子1，内含子5′的边界序列上的G与5′磷酸和分枝点A的2′-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构；第二步是切下的外显子1，其3′-OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻，切下的外显子2′的5′磷酸和外显子1的3′-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子。

通过对以上两种内含子的研究，提出“核酶”概念。

核酶(Ribozyme)有的译成为核糖拟酶，核酶等，目前尚无统一的译法，暂以核酶称之，既简单明确，也能反映其酶的本质。核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜虫rRNA时发现的，1982年T.Cech将核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”,它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质，这类物质具有催化功能，但和酶又有区别，主要表明在两个方面：①一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；②核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。 3、核mRNA的剪接

结构和Ⅱ类内含子十分相似，符合GU-AG法则，具有分支位点。但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。它们自己本身不能象I类及Ⅱ类内含子那样依赖核心结构，形成茎环，将5′和3′剪切点拉在一起。和snRNA的结合是相当复杂的，但剪接反应的第一步5′位点的剪接是由U6催化的，3′位点是由5′外显子1的3′-OH对内含子3′端切点进行转酯反应来完成。

4．相关概念

可变剪接；反式剪接；RNA编辑

第五节 逆转录