双缩脲法定量测定蛋白质

实验46.双缩脲法定量测定蛋白质

一、实验目的

1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。 2、掌握分光光度计的使用，初步了解比色法的基本原理。

二、实验原理

蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu离子等络合生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。经比色法求出尿中蛋白质的含量。反应如下：

双缩脲试剂 双缩脲 双缩脲-铜-钾-络合物（紫色） 2+

三、实验试剂与材料仪器

试剂

1.标准酪蛋白溶液（10mg/ml）

酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据纯度称量配成标准液10.0mg/ml，用0.05N氢氧化钠溶液配制。 2. 双缩肽试剂

取硫酸铜（CuSO4·5H2O.AR）1.5G和酒石酸钾钠（KNaC4H2O·4H2O.AR）6.0g分别用蒸馏水250ml溶解后，一并转入1000ml容量瓶中混合，再加入10%的NAaOH溶液300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释到刻度，贮存于塑料瓶中，可长期保存，如有红色或黑色沉淀出现，需重新配制。

3.未知浓度酪蛋白溶液：称取上述实验中酪蛋白0.5g，放入100ml烧杯中，加25ml0.2NNaOH溶液，摇匀隔水加热，将溶液转移到50ml容量瓶中。用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度，摇匀，置冰箱中保存。 仪器

1.721分光光度计（使用光径为10mm的比色皿） 2.刻度吸管1ml1支、2 ml2支、5ml1支 3.试管（15mm×150mm）7支 4.托盘天平 5.分析天平

6.量筒：500 ml、100 ml各1支 7.容量瓶：50 ml、1000ml各1支

8.恒温水浴（20-25C，如室温接近可不用）。

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四、实验方法

1. 标准曲线制定：取6支试管编号，按下表加入试剂 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 标准酪蛋白溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白浓度 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 A540

上述试剂加完后，混匀，室温放置30分钟以内测完，比色（540nm）。记下各管光吸收度，做A540-蛋白质浓度曲线。

2．样品测定：取未知酪蛋白浓度样品液三管各1.0ml，同上6号管操作测光密度，在标准曲线上查出其对应蛋白质毫克数，即为所测酪蛋白溶液浓度（mg/ml）。

3.计算

固体样品蛋白质的含量（%）=

Y?N?100% C其中，Y为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/ml），N为稀释倍数， C为样品原浓度（mg/ml）。

五、注意事项

1. 本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg

蛋白质。

2. 须于显色后30分钟内比色测定，30分钟后，有可能出现雾状沉淀。各管由显

色到比色的时间应尽可能一致。

3. (3)有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或

石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。

六、思考题

干扰本实验的因素有哪些？