DGGE步骤

2.1.2.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法

1）配胶

DGGE梯度胶配方如表2.4所示：

表2.5 30%、35%及60%变性梯度溶液配方

药品/梯度 40%A/B 50×TAE FA Urea 灭菌水

30% 4mL 0.4mL 2.4mL 2.52g 至20mL

35% 4mL 0.4mL 2.8mL 2.94g 至20mL

60% 4mL 0.4mL 4.8mL 5.04g 至20mL

2）灌胶

安装玻璃板，玻璃板应清洁和干燥。

分别向低梯度胶和高梯度胶中加入120μL 10％过硫酸胺溶液（在4℃储存不超过7天），混合均匀，再分别加入17μL TEMED，迅速混合。然后迅速注射器吸取不同梯度的变性液并按顶端灌样方式安装并固定在梯度形成仪的两端卡槽上，高浓度的在外面，然后以匀速灌胶。在灌胶结束后立即安装梳子。胶的凝结时间大约为2到3小时。

为防止胶在注射器中凝结而堵塞吸管，应立即清洗注射器。 3）跑胶

灌胶后，配制7L新鲜的1×TAE缓冲液并填加到电泳槽中。

将集电泳、加热、温度控制盒、搅拌和循环水泵为一体的设备放置在电泳槽中，打开并预热至60℃。

将胶模安装到支架上。

用1L的烧杯从电泳槽中取出约500mL的1×TAE缓冲液。

将胶模支架放置到电泳槽中，将约500mL的1×TAE缓冲液填加到支架上部的小槽中打开泵开关和加热开关，设置电泳电压和电泳时间，开始电泳。

电泳结束后，关闭电泳电源，关闭加热开关和水泵开关，一分钟后将支架和胶模取出，卸下胶模，小心拆卸玻璃板。

将集电泳、加热、温度控制盒、搅拌和循环水泵为一体的设备放置在电泳槽

中，打开电源、加热开关和水泵开关，并预热至60℃。

然后拿下电泳设备顶端盖子，将30μL的PCR产物和6×Loading buffer以5：1的比例混合，点到梳孔中，盖上盖子。

打开泵开关和加热开关，在100V运行条件下连续运行12小时。

电泳结束后，关闭电泳电源，关闭加热开关和水泵开关，一分钟后将支架和胶模取出，卸下胶模，小心拆卸玻璃板。

4）染色和UVP仪照相

取稀释104倍数的SYBR Gold染色剂15mL涂于胶表面染色20min，后用去离子水中漂洗，用UVP仪照相。

5）DGGE胶上片断的回收测序

用刀片切取DGGE胶上的独立的16S rDNA条带置于2mL离心管中，用50μL 高灭菌水纯水浸泡。

将离心管放置在4℃冰箱中过夜，以使DNA片断从胶中慢慢扩散出来。取1μL的DNA浸出液作为模板，应用本研究PCR扩增条件进行PCR扩增（此次扩张引物不带GC卡）。

将在408bp和510 bp左右检测到足够亮度的条带的PCR产物送诺赛基因公司测序。

6）数据分析方法

（1） 直观观察DGGE指纹模式，识别优势菌。

（2）登陆NCBI ( http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/ )，测序结果通过在GenBank database里面进行BLAST，寻找出进化关系最亲密的物种。利用MEGA3软件，进行多序列对比，以邻近法绘制系统发育树。

图 3 Bio-Rad公司DGGE电泳仪