多肽类药物

多肽类药物

多肽和蛋白质类生物药物按药物的结构分类可分为：氨基酸及其衍生物类药物、多肽和蛋白质类药物、酶和辅酶类药物、核酸及其降解物和衍生物类药物、糖类药物、脂类药物、细胞生长因子和生物制品类药物。

结构分析

多肽的定性至少应包括氨基酸分析、序列分析及质谱分析。纯肽的氨基酸分析可提供该多肽的氨基酸组成和数量。序列分析则提供氨基酸残基的精确排列顺序。基于多种技术的质谱, 如快原子轰击、电喷雾、激光解吸, 经常用于提供多肽的相对分子量及其序列信息。肽谱是蛋白质或多肽通过酶解得到的肽片段经分离和分析所得到的“指纹图谱”。当多肽含有20 个以上的氨基酸残基时, 肽谱分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。 2. 1 氨基酸分析

用于氨基酸分析的水解方法主要是酸水解, 同时辅以碱水解。酸水解中使用最广泛的是盐酸(一般浓度为6mo l?L )。多肽于110 ℃真空或充氮的安瓿瓶内水解10～ 24 h, 然后除去盐酸。水解过程中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系, 因此该氨基酸在多肽中的真实含量可通过以不同的保温时间对相应时间的样品中该氨基酸的含量作图, 用外推法求出。高氨基酸分析仪的使用使氨基酸的分析越来越准确, 如W aters 公司的氨基酸分析系统的检出限已达100 fmo l。 2. 2 序列分析

氨基酸测序主要为化学法, 酶法也有一定的意义。化学法以Edman 降解法最为经典, 它对所有氨基酸残基具有普适性和近乎定量的高产率, 是近50年N 2端顺序分析技术的基础。Edman机理的液相(旋转杯) 自动蛋白顺序分析仪在1967 年推出。近年来不断对其改进, 其灵敏度已达到可以对0. 1pmo l 的样品进行常规分析。 2. 3 质谱(mass spect romet ry,M S)

质谱以质量分析为基础, 可提供化合物的分子量以及一些结构信息。1980 年代以后发展了许多新的“软电离”技术, 使其在蛋白质多肽分析中的应用越来越广。目前应用较多的有原子轰击、电喷雾和基质辅助激光解吸质谱。质谱测序是对Edman 降解的一个很好补充, 它可对N 2端封闭的多肽进行测序; 并可以通过碰撞诱导断裂(C ID ) 得到部分至完全的序列信息后, 作出M S2肽谱, 这可对修饰的氨基酸残基定性, 并确证其位臵。而且质谱技术与分离技术如HPLC、HPCE 直接相连可相互验证, 同时还可对混合肽进行测序。

2. 3. 1 快原子轰击质谱(fast atom bombardmen t2mass spect romet ry, FAB2M S)FAB2M S 克服了传统质谱中样品必须加热气化的限制, 可对热不稳定、难挥发的蛋白质多肽进行分析。与其他质谱技术相比, FAB2M S 更适合于小分子多肽的检测[6 ]。FAB2M S 测定肽的氨基酸序列具有用量少、方便和快速的优点。一些寡肽, 特别是人工合成的有保护基的寡肽在遇到N 2端封闭不宜用氨基酸序列仪测定其结构的情况下, 有可能用少量样品采用FAB2M S 直接获得寡肽的分子量和氨基酸序列。俞振培等[7 ]用FAB2M S 对7 个带有不同保护基的3～ 5 肽成功地进行了氨基酸序列研究。串联FAB2M S 将第一次轰击得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击, 使肽链在不同部位断裂, 从而得到一组片段的质谱信息, 使多肽测序得以实现

2. 3. 2 电喷雾质谱(elect ro sp ray ion izat ion2massspect romet ry, ES I2M S)

ES I2M S 由于可以产生多电荷峰, 与传统质谱相比扩大了检测的分子质量范围, 提高了灵敏度, 可以得到准确的分子量。ES I2M S 可分为正离子和负离子, 一般多肽和蛋白质的ES I2M S 分析总是以正离子方式进行。ES I2M S 的最大优势是可直接与HPLC、HPCE 联用, 能在多肽酶解后得到HPLC 或HPCE 肽谱的同时得到一张精确的质量肽谱(肽谱和质谱的结合称为质量肽谱)。ES I2M S 在质量肽谱图中能得到分子量低于400u 的小分子肽段, 可以鉴 定一些在其他质量肽谱图中不能区分的肽谱[9 ]。在质量肽谱中应用ES I2M S 可提供一种快速证实多肽氨基酸序列的方法。ES I2M S 所产生的多电荷离子特别适用于串联质谱分析, 用来检测目标肽段, 可得到完全的序列信息。王贤纯等[10 ]运用串联ES I2M S 解析出7 肽及其修饰产物、10 肽、20 肽的氨基酸序列。

2. 3. 3 基质辅助激光解吸质谱(mat rix2assistedlaser deso rp t ion ion izat ion2mass spect rometry,MALD I2M S)MALD I2M S 克服了直接用激光解吸离子化的缺陷, 为分析非挥发性、热不稳定的大分子提供了一种较好的离子化方式。它的最大优点是允许样品中含有几百毫摩尔的缓冲液及表面活性剂, 且灵敏度比别的离子化方式高, 可至fmo l 级[11 ]。MALD I2M S

能有效地分析较复杂的肽混合物, 特别适合混合蛋白质多肽类物质相对分子量的精确测定。周红华等[12 ]用基质辅助红外激光解吸质谱法确证了3 种寡肽的一级结构, 为测定寡肽的分子量和一级结构提供了一个简便、快速、准确的方法。

2. 4 核磁共振( nuclear magnet ic resonance,NMR)NMR 因图谱信号的纯数字化、过渡的重叠范围过宽和信号弱等原因, 以往在多肽物质的分析中应用不多。随着二维、三维以及四NMR 的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,NMR 逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR 可用于氨基酸序列、定量混合物中各组分组成含量等的分析中。NMR 在分析少于30 个氨基酸的小肽时是非常有用的, 可以达到快速准确分析的目的[13 ]。L indon等[14 ]HPLC2NMR 联用, 在连续流动模式下对27个合成的多肽混合物进行了分离和鉴别, 快速得到了各多肽的结构。

2. 5 肽谱分析(pep t ide mapp ing)

肽谱分析是多肽药物质量控制的重要手段。肽谱对每一种多肽药物来说都是特征、专一的。通过肽谱分析可以鉴别多肽, 预测其一级结构特征, 比较功能相近多肽结构的类似性和各批产品一级结构的一致性。肽谱分析根据多肽分子量大小以及氨基酸组成特点, 使用专一性较强的蛋白水解酶(一般为肽链内切酶) 作用于特殊的肽链位点, 将多肽裂解成较小片段, 通过一定的分离检测手段得到特征性的指纹图谱。肽谱分析对于蛋白质多肽的结构和特性鉴别

具有重要意义, 已成为许多蛋白质多肽药物质量控制的重要方法[15 ]。 2. 5. 1 凝胶电泳(PA GE) 肽谱分析

双向电泳、等电聚焦电泳等凝胶电泳技术在蛋白质多肽的纯度、杂质检查以及分子量、等电点、含量测定等方面发挥了重要作用。双向电泳作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一, 仍然是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具。对于分子量大于10 ku 的蛋白质, 凝胶电泳技术已日臻完善; 而对于分子量小于10 ku 的小分子多肽分析总是不尽人意。银染SDS2PA GE 微量肽图法适于CNB r 裂解的较大肽片段的分离检测, 而对酶裂解的肽段, 由于其分子较小, 检测效果不佳[16, 17 ]。随着生物检测技术的不断发展, 本法逐渐被灵敏度更高的肽谱分析方法所替代。 2. 5. 2 HPLC 肽谱分析

由于HPLC 分辨率及检测灵敏度较凝胶电泳高得多, 当多肽药物经作用于特殊肽链位点的蛋白酶裂解, 得到一系列的肽片段后, 可用HPLC 有效地鉴定基因工程产品、天然产品以及有关的杂质。杨化新等[18 ]通过RP2HPLC 法采用C18柱, 检测了经胰蛋白酶裂解的多种重组人

生长激素(rhGH)肽片段, 成功地获得了rhGH 特征性的胰肽图谱。张培培等[19 ] 利用V 8 酶专一性裂解Glu 的羧基端肽链, 通过RP2HPLC 法采用C8 柱, 对胰岛素进行了肽谱分析, 成功地将来自不同种属、结构仅差1 个氨基酸的胰岛素与重组胰岛素进行了鉴别。L ahm等[17 ]和Garn ick 等[20 ]也分别用HPLC 对重组人白介素22 及rhGH 进行了肽谱分析。诸多成功的应表明HPLC 肽谱分析在多肽药物质量控制中具有广阔的应用前景。 2. 5. 3 HPCE 肽谱分析

HPCE 是近十几年发展起来的一项新的分析技术, 它将电泳技术和色谱技术结合, 具有分离效率高, 速度快、模式多等特点。毛细管的柱效与样品分子的扩散系数成反比, 而蛋白质、多肽具有扩散系数小的特点, 这意味着HPCE 非常适合于蛋白质及多肽的分析研究[21 ]。多肽分析中常用的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等。在用HPLC 进行肽谱分析的过程中, 因亲水性多肽在反相柱上不保留, 某些结构相差1 个氨基酸的多肽片段难以分离。而采用HPCE 进行肽谱分析时, 因为结构相似或氨基酸组成相同而顺序不同的多肽所带的电荷不同, 可通过调节电解质的pH 使迁移时间改变而达到分离。F renz 等[22 ] 分别利用RP2HPLC 和HPCE 对胰蛋白酶降解的rhGH 进行分析, HPLC 出峰大约需时150 m in, HPCE 仅需12m in; 在HPLC 色谱图中未出现的峰在HPCE 中出现了; 收集HPLC 的单峰在HPCE 中运行, 出现了两个峰。此研究结果表明HPCE 是肽谱分析中更有效的工具。

含量测定

1 HPLC

到1980 年代HPLC 就已发展为检测蛋白质多肽结构和纯度的重要分析工具。它用于定量分析具有灵敏、精确、快速的特点, 现在多肽的纯度分析大都采用HPLC 法。包括反相、离子交换和疏水性相互作用在内的HPLC 技术都可用于检测多肽的纯度。对胰岛素的鉴别和含量测定, 中国药典2000 版和美国药典23 版均采用了HPLC 检测方法。董文玉等采用HPLC 成功地将由组合化学合成的10种结构相近的目标多肽与其它杂质分离, 确定了目标多肽的纯度。通常与HPLC 连用的紫外或荧光检测器无法分辨性质相近的组分间的细小差别, 常常造成结果的偏差。近年来出现的HPLC2M S、HPLC2M S2M S或HPLC2NMR 等联用技术, 使HPLC 能更快速准确地分析样品的组成和纯度。 2 HPCE

与HPLC 相比, HPCE 分离效率更高、上样量更少, 是一种灵敏的蛋白质多肽纯度检测方法。有些多肽在HPLC 上测得纯度为100% , 但在HPCE 分析时纯度仅为90% , 也就是说HPLC 中的单峰在HPCE 中出现多个峰。胰岛素、生长抑制素等多肽药物已有用HPCE 进行纯度分析的报道。HPCE 较差的检测限是该分析方法在纯度分析应用上的一个限制。有研究者采用堆积方法有效地克服了这个问题, 使检测信号大大增强。

鉴别试验

1.1 生物检定法

由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定 法 有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。

1.1.1 在体分析 常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各 类蛋白多肽的生物活

性 不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质[1] 而建立 的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物 ，费时费力，灵敏度不高，变异较大。

1.1.2 离体组织（细胞）分析 如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素 的大鼠离体子宫法等。 随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常 用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法 （Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(Cytopathic effect reduction assays ) [2],则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观 灵敏, 但 可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直 接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法 等。此外，还有根据蛋 白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法[3]，结合酶反 应的酶诱 导分解法[4]等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其 不足也显 而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次 ，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反 应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度 ；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。

1.2 免疫学方法

免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物 ，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常 用的方法有三种。

1.2.1 放射免疫法（Radioimmunoassays RIA） 该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性 取决于抗原抗体的亲和力及标记药 物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。 1.2.2 免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA） 该法中 被测药物依然是Ag，它 先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心 状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法， 只是对标记抗体的纯度要求很高。 1.2.3 酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA） ELISA的原理与IRMA相 似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上 述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明 ，它与生物检定法具有一定的量效关系[4]及相关性[5]，提示它可部分地 反映药物的生物活性。

免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢 物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反 应可能有较大的差别；还可能受到内源物质的干扰。但免疫法毕竟是一种迅速，灵敏，适于批处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力学研究的商品药盒。临床 药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。 1.3 同位素标记示踪法

放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处臵的一种最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单 而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成 体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用；二是