生物技术制药复习提纲2010（整理版）

③贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）：微载体培养、包埋和微囊培养、结团培养 2）操作方式：分批式操作、半连续式操作、灌流式操作 植物细胞的培养操作方式

①成批培养法；②半连续培养法；③连续培养法；④固定化培养法 8、抗体的基本结构及每一区域的功能作用

9、简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优点

单链抗体是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。在scFv中，连接肽的长度一般为15个氨基酸，常选用甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）构成一段具有一定弹性及蛋白酶抗性的多肽，其序列为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3，其作用是既连接VH、VL，又保持一定的灵活性，使VH、VL的功能区间在折叠后仍可配对。

优点：①分子小，容易进入组织（包括肿瘤），可用于肿瘤的诊断和治疗；②因其为单链，易于进行分子改造；③体内半衰期短、免疫原性低。 10、试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理

环糊精（CD）是一种优良的模拟酶，可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。环糊精分子是由多个D-（+）-吡喃葡萄糖残基通过a-1,4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现无扭曲变形的椅式构象，整个分子组成略呈锥形的圆筒，分子内有空穴。环糊精分子的疏水区处于空穴内侧，亲水区处于环状分子外侧。当一个与环糊精的空穴相适应的疏水分子遇到环糊精时，则进入它的空穴中与之“契合”（包结）。在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十分相似。

三、技术方法

1、基因工程药物制造流程

获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→

- 5 -

产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 2、试述获得目的基因的一种方法

1）鸟枪法：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。

局限性：工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子结构。 2）cDNA法（反转录法） ①mRNA的纯化

②cDNA第一链的合成 ③cDNA第二链的合成

自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 ③双链cDNA的克隆

平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段

加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 ④目的cDNA文库的鉴定

局限性：①并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；

②细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；

③mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难； ④仅限于克隆蛋白质编码基因

3）PCR法

PCR法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 4）化学合成法

较小分子蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成

必须已知目的基因的核苷酸排列顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序 ①合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段 ②退火成为两端形成粘性末端的双链DNA片段 ③按正确的次序退火使连接成较长的DNA片段 ④再用连接酶连接成完整的基因

局限性：不能合成太长的基因；遗传密码的简并性，中性突变；费用较高 3、如何将目的基因与载体进行连接(几种末端的连接策略)

1）应用相同或不同的限制性内切酶酶切目的基因和载体，产生相互互补的粘性末端

2）将非互补粘性末端改造、修饰成完全平头或形成相互互补的粘性末端 3）平头末端直接与载体连接 4）平头末端分别加同聚物尾 5）加装人工接头引入酶切口

4、单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。 1）抗原与动物免疫

- 6 -

①制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫

②多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、克隆化

③为使杂交瘤细胞稳定，一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫 ④免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择

①细胞融合的方法：取适量脾细胞（1×10^8）与骨髓瘤细胞（2~3×10^7）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。

②细胞融合后可产生多种融合：脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞 ③选择性培养基：HAT培养液、次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T） A阻断DNA合成

3）筛选阳性克隆与克隆化

①筛选阳性克隆常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 ②克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。 4）杂交瘤细胞抗体性状的鉴定

①对杂交瘤细胞进行染色体分析，既是鉴定的客观指标，又能了解其分泌抗体的能力。

②可用羊或兔抗Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA法来鉴定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。此外还须进行亲和力、特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量等进行测定。 5）单克隆抗体的大量制备

体外培养法：可获得10 μg/ml的抗体

动物体内诱生法：可获得5~20 mg/ml的抗体

BALB/c小鼠→提前几周腹腔注射降脂烷→接种杂交瘤细胞→取腹水→离心→取上清

6）单克隆抗体的纯化

依单克隆抗体Ig的类和亚类的不同，采用各种不同的纯化方法。 动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化过程如下： ①澄清和沉淀处理：离心、取上清、超滤、盐析

②分离：凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化 阴离子交换层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化 亲和层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化 5、简要说明酶的固定化方法 1）载体结合法

①物理吸附法：通过氢键、疏水作用、π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶性载体上，从而制成固定化酶。

有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等

无机载体：活性炭、氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等 ②离子结合法：是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。

③共价结合法：使酶分子上非活性部位功能团与载体表面活性基团之间发生化学反应而形成共价键的连接方法。

- 7 -

2）交联法：是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。

3）包埋法：酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在高分子凝胶细微网格中或高分子半透膜中，分为网格型和微囊型两种。只适用于小分子底物和产物的酶。

6、固定化酶反应器的类型特点及选择依据 固定化酶反应器的类型特点：

1）间歇式搅拌罐反应器：用于游离酶反应后随即放料 2）连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料

3）填充床反应器：固定化酶填充于床层内，反应器内的流体的流动形态为平推流形，底物以恒定流速通过反应床。

4）流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。

5）循环反应器：部分反应液流出，和新加入的底物流入液混合，再进入反应床进行循环。 6）连续流动搅拌罐-超滤膜反应器：由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器，它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜。 7）其他反应器

反应器的选择依据：

①根据固定化酶的形状来选择 ②根据底物的物理性质来选择

③根据酶反应的动力学特性来选择

④根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择 ⑤根据操作要求及反应器费用来选择

四、实践与进展

1、已知拟南芥中某一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，请选择一种单细胞微生物，设计一个实验流程确保能得到最终产物。

酵母是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，其基因组小，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。酵母繁殖迅速，可以廉价地大规模培养，而且没有毒性。能够将所表达的产物直接分泌出细胞外，从而大大简化了产物的分离纯化工艺。表达产物能糖基化。因此，选择酵母作为宿主菌。

流程：获得目的基因（人工化学合成法或染色体DNA的限制性内切酶酶切）→组建重组质粒→构建基因工程菌（选择酵母作为宿主菌）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→最终产物

2、最近发现一种新型病毒，你如何开发一种该病毒的诊断试剂？

利用血清学鉴定的原理，设计血清学鉴定用的抗体试剂作为诊断试剂。参照HBsAg的反向被动血凝诊断试剂的制备，设计流程如下：

1）制备该新型病毒抗原；

2）用病毒抗原免疫豚鼠，获得抗病毒血清，提取相应特异性抗体； 3）将人新鲜“O”型红细胞用丙酮和甲醛处理 4）用纯化的抗病毒血清致敏醛化血细胞 5）洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。

- 8 -