cas9研究历史（转自一个研究生作业）（这是今年5月份写给吴畏老师的） - 图文

图8 Csn2参与整合spacer模型

移花接木，给细菌打“疫苗”！

于是就有人在想，既然这看起来是个不错的免疫体系，既然大肠杆菌中这个体系看似不够强悍，能不能移植啊？

答案是肯定的。2011年，NAR杂志上，法国的一个课题组【4】正是做了这样的一件事情——将Streptococcus thermophilus嗜热链球菌中的Type-II CRISPR系统利用质粒系统移植到了大肠杆菌当中，发挥了作用！于是他们很愉悦的得出了结论——CRISPR是可以用来给细菌打疫苗的，我们了解他的天敌，就可以主动防御，先发制人。 同时，几乎是“顺带”，他们还发现了2件事情，

1、Cas9“一粒起效”——作为唯一需要的，足以起作用的剪切蛋白（强悍性充分性）。 2、Cas9“左膀右臂“ ——起作用依赖McrA/HNH- 和RuvC/RNaseH这两个motif. 。从此Cas9也从那么多Type【16】的CRISPR的蛋白中，款款走入了我们的视线。

图9 利用质粒实现Cas9-嗜热链球菌CRISPR系统往大肠杆菌的移植

所以说第一次，他们证明了CRISPR不但可以免疫自己，还可以异源表达，免疫他人，这就是“疫苗”啊，很有意思。

然而从故事的后续发展来看（如果我梳理的逻辑中没有落掉太多东西），他们实在浪费了一块宝藏，大材小用了。而这篇文章结果的重要性也被研究者本身严重低估了。不能说他们愉悦的结论和细菌的疫苗不重要，只能说他们只看透了一层，没有看到更深的一层，没有看得更远。

为什么这么说，因为虽然他们没看到，但是有人看到了。并且真正成功的奥秘就在于那两件顺带的发现。

“一粒起效”，果断改造——从此剑锋直指！

如果要在CRISPR系统的研究中树一块里程碑，我想【2】他是。如果要在这个故事里有个转折，我想他【2】也是。从这里开始，CRISPR的传奇将开始上演，新一代分子生物学革命的帷幕即将拉开！

2012年8月17，一篇看似低调的Science，看那些胶图和data也没什么意思，这里用我的语言简单总结一下他们主要做了些什么：

是的，流水账一样，到这里这文章看起来没啥难度，也没啥亮点。但是，细心地你发现了吗，到这里，他们已经一步一步的把Cas9作为定向内切酶的每一步机制，方方面面都搞清楚了。

插一句，又有一个被忽略（至少在这篇文章里没大动作）的意外惊喜——2个“左膀右臂“domain是各切一条链，HNH domain 切 complementary DNA strand， RuvC-like domain 切 noncomplementary DNA strand 。

接着说，他们把方方面面都搞清楚了，但这仅仅是一个机理研究吗？错！他们有非常明确地目的——剑锋直指！可以人为定制的特异性内切酶！为我所用，指哪打哪。

他们紧接着就利用这些发现，设计，做了体外切割GFP基因的实验，果然获得成功。并且都是按照预想的设计的切口切开，这难道不是“想切哪里切哪里，妈妈再也不用担心我的课题”？。

同时，推断由于限制性的PAM的序列NGG很常见，基本上利用的限制很少——有望可以实现见人杀人，见鬼杀鬼！并且2个必须的RNA已经可以“双剑合璧”，这样可以使构建的RNA更方便也更稳定。一个新型“大杀器“呼之欲出。

图10 crRNA 和 tra crRNA的“双剑合璧”【2】

（对了，这里要特别提到的是【13】，和【2】内容非常相似，同年9月4号的PNAS，如果没什么意外，应该是晚了一步。看来做科研，不但找准方向，下手稳准狠，动作还要快啊！） 好了，现在已经是“司马昭之心，路人皆知”了，再笨我们也猜到他们的目的了——构建一个可以按需定制的DNA定点剪切工具。然而又一次，我们要说，技术和发现放在那，决定高度的是你能看多远。（也有可能他们想到了但还没做到） “万事俱备，只欠东风”。基础已打好，序幕已拉开，热场已完成，真正的好戏就要开演了。

三、 “洲”际导弹，秒杀众生

——多种真核、原核细胞中的基因编辑、合成生物学利器

刚才的序幕估计只是让关注该领域的人激动兴奋了一下（而且好多人也正是从关注这篇文章开始进入领域，开始抢滩），然而真正让CRISPR系统走进所有人的视野，发出不容