cas9研究历史（转自一个研究生作业）（这是今年5月份写给吴畏老师的） - 图文

这是今年5月份写给吴畏老师《基因分子生物学》课程的一篇作业。今天突然想到，虽然最火的时间已过，但最近很多同学都在用到渐渐商业化的cas9工具、或者接触这一2013年毫无疑问的科学热点（上周医学院的一篇PNAS）。想斗胆拿出来跟感兴趣的大家分享一下，欢迎讨论和各种批评。

但是局限性很大，抛砖引玉吧。因为第一，习作的成文非常仓促（嗷嗷嗷我是拖延症），除2-3篇提前看过，大部分资料查阅在1星期内的课余时间，成文只是deadline前的一个晚上。。。。第二，当时还非lab课题，自己很多YY，水平实在非常有限，非常浅薄！！（求轻喷）！！！！第三，5月份到现在又发了很多文章，认识进一步深化，这里还未能跟进。

非常感谢当时吴畏老师的鼓励和肯定。我觉得相当于是戏说吧~不知道能不能作为不太严谨的科普：）

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“小东西”搞出“大名堂”

—CRISPR/Cas系统的研究故事

写在前面：

2013年元旦刚过，社交网站上一篇“我校优秀校友丛乐science发文”的帖子被上至5字班下至2字班横跨8届的清华生院同学们疯狂转载，为了一个传奇学长的传奇继续。然而在这座园子里，同时为此文激动不已的还有许多老师，他们当然不在乎丛乐是何许人也，但是却毫不吝惜的甚至将这篇文章[1]誉为“不亚于PCR的重大突破”。是否真的能达到PCR的高度尚未可知，但开启了分子生物学的一个新的时代却毫无疑问。

其实并不是丛乐的这篇文章开启了一个新的时代，客观的说这个时代的开始是注定的，只是早晚问题。在上述激动不已的人群里面还有一个打酱油的我，因为就在几个月前，无意中发现了一篇2012年8月的science—A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity [2]（还为此回头看了看CRISPR系统[3]感觉好有意思） 当时就觉得必有下文，没想到来得这么快影响这么大，而且细看发现丛乐的文章似乎完全基于上述这篇science。第一次，有了一种追踪到科学发展的两眼放光，兴奋激动。而后的follow，更是发现了更多好玩的东西[4] [5] [6]。串起来，似乎真是个STORY。 这序实在略长，不过最后想说，由于是一个自己觉得蛮好玩的STORY，加之不是我们自己做的课题的相关，完全出于兴趣，认识非常浅薄，也做不到一篇严谨深入的综述，就干脆尽量写的好玩生动通俗一点，于是把精读泛读的好玩东西都攒过来，大胆联想附会，有谬误出格的地方还多担待。 正文：

在表观遗传学、干细胞、癌症研究如火如荼的今天，大家似乎都把目光投入了更加“高等”的生物。然而原核CRISPR系统的发现和应用却再次证明了“低等”生物的存在感——谁说这些“小东西”不能有精妙复杂的体系？

CRISPR系统不但丰富了我们对于细菌、古细菌生理机制的认知，更重要的是这种体系的改造利用能带来席卷整个分子生物学领域，更新现有操作模式的一场技术革命。同时，它也为我们打开了一扇窗，从CRISPR的角度重新认识整个微生物世界自我和相互间的调控网络、调控机制，原核及真核细胞间的异同和联系，甚至协同进化的证据。 没人能否认，这次，“小东西”的确搞出了“大名堂”。

一、 初露锋芒，刮目相看

——细菌也有“高级”的获得性免疫系统

到底什么是CRISPR？ ——它的中文名很长很拗口，和英文一样不知道怎么念，却能顾名思义，了解其基因序列上的特点，那就是——成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。 既然是讲故事就把关子卖到最后，讲到那里再告诉大家这些定语的含义。

是个啥？

任何伟大事物的开端（原谅我下此断言，不过看溢美之词甚盛【21】【22】，也不算过分），任何风云人物的发家，任何跌宕故事的开始，总是不起眼“其貌不扬”的，我们的主角CRISPR系统也不例外。

很多综述【3】里都把CRISPR的起源说在了1987年，还是从我们最熟悉的E.coli,最经典的K-12株系中发现的，但是本着挖祖坟的心态费劲找出这篇26年前的文章【7】来考据，却发现似乎其中只有这一点是与我们的CRISPR沾边的，就是这个回文序列。

图1 最初在大肠杆菌中发现的CRISPR序列迹象【7】

“叫”个啥？

这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字，直到2002年，在通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字

CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）【8】。并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一写CRISPR-associated基因。也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了CRISPR系统中最重要的3大元件—spacer（白色方块），回文repeats（双三角），cas等基因。

图2 CRISPR特征序列模式图

“干“个啥？

一开始，由于spacer序列种内保守，种间差异的特点，一度甚至现在【30】也在被用来鉴定菌株，回头看来虽然大材小用，但好歹也是广泛应用性的体现。

还是和大多数科学发现一样，CRISPR系统的发现经历了一个搞清：是个啥？——“叫”个啥？—— “干”个啥的过程。

现在我们已经知道他长得什么样子什么特点，可是关于这一奇怪序列是干什么的，在很长一段时间里众说纷纭。

功能显然和spacer的序列特异性有关，那么是chromosomal rearrangement？ modulation of expression of neighboring genes,target for DNA binding proteins,？replicon partitioning,还是DNA repair？

都有道理不过只是猜测，直到2005年，3个课题组独立的数据分析表明——这些spacer是外源DNA来源的，病毒或者质粒。【3】于是才让大家想，外源DNA，这会不会参与了防御外来DNA呢？

2007年Streptococcus thermophilus的实验证实了这一猜想，于是经过不断完善，有了我们下面这张华丽丽的示意图，一个只能用elegant形容的漂亮的免疫过程。

漂亮的获得性免疫系统——谁说这是“高等”生物的专长？

如何解说这个漂亮的系统，我想参照我们学过的抗原抗体免疫很容易理解，这里用一个通俗的比喻（如下图3）简单讲讲。

外源DNA就是坏蛋，而抓住坏蛋特征这一最核心的步骤之一则是——靠的Cas复合体将片段特征proto-spacer制作成spacer，整合进CRISPR序列中，形成记忆。于是接下来的2次免疫中，spacer便可以快速bingding到proto-spacer上。完成这一target的精确打击过程。干掉入侵者。

估计大家也都注意到了一个特别的“帽子“ PAM（下文中也会提到）这里作为一个防止自身免疫的机理出现，不难想到当然也同时也制约了proto-spacer的选择。

图3 参照图4的免疫流程