第二篇第八章 多聚酶链式反应

第二篇 技术篇 第八章 多聚酶链式反应

1、基本原理

PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成

设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。

（2）DNA模板的变性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。

（3）模板与引物的结合（退火或复性）

解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 （4）引物延伸

将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。

以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 2、PCR反应体系与反应条件 （1） PCR反应体系

? 模板

单、双链DNA均可。

不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100?L。

模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

? 引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 ? Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 ? dNTP

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dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等

浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量，dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性

? Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

（2）反应条件

3、引物的复性（退火）温度

复性温度的选择可以根据引物的长度及其G+C的含量确定。

当长度在15~25bp时，引物的复性（退火）温度可以通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到。

在Tm允许范围内，Tm越高，PCR特异性越强。 4、PCR引物设计的一般原则

（1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度适宜，一般为15-30 bp； （3）引物中G+C占40-60%；

（4）碱基尽可能随机分布,尤其3’端不能以3个连续G或者3个连续C结束。否则，会使引物在模板G十C富集区引发错误；

（5）引物内部避免形成二级结构（不存在互补序列）；

（6）两引物间避免产生引物二聚体（互补碱基不超过4个） ； （7）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制；

（8）引物3’端就不要终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位易出现简并现象 引物设计流程

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