药物活性筛选实验

第二章 关黄柏血中移形成分抗前列腺癌活性评价 1 实验材料 1.2 仪器与试剂 1.1.1 实验仪器： CO2培养箱 紫外消毒柜 倒置荧光显微镜 倒置显微镜 超微量分光光度计 离心机 干燥箱 荧光读板仪 低温离心机 生物安全柜 电子分析天平 超纯水机 离心机（小） 电泳仪 电泳成像仪 荧光PCR仪 梯度PCR仪 磁力搅拌器 立式蒸汽压力灭菌器 水浴锅 流式细胞仪 1.1.2 实验材料：

HEK293/α1D-AR/Gα16稳转细胞系，22RV1人前列腺癌细胞（ATCC），ABT-594和RJR2403阳性化合物，96-孔黑边透明底 Greiner plate（μClear/Clear Bottom）,Milliporeviacount reagent，DMEM高糖培养液（Applichem，Germany）,HBSS( Hyclone, USA),台盼蓝（Sigma，USA），RPIM-1640(HyClone),FBS,Antibiotics，DMSO，Trypsin-EDTA，HEPES，MTT,Fluo-4 AM免

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洗钙流检测试剂盒，乙醇其它试剂均为分析纯级。 2 方法 2.1 细胞株培养

细胞的复苏培养 从-80℃中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/mL密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养于含有10?S的RPIM-1640培养液中。消化细胞使用含 0.05íTA的Trypsin溶液。 2.2 细胞的传代

22RV1人前列腺癌细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。并冻存细胞备用，冻存细胞使用含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2.3 细胞形态的观察

在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。 2.4细胞的计数

常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用milliporeviacount按比例重悬并吹打制成细胞悬液。预热guava流式细胞仪，进行流式细胞仪的细胞计数分析。 2.5细胞的贴壁率

指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。 2.6生长曲线

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。

以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1mL培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。 或采用台盼蓝计数法：

(1)取不同时间段生长的原代小鼠肝细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数 (2)根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 MTT检测法：

（1）细胞接种在96孔板上，200ul/孔，培养基代替细胞悬液做为空白对照。 （2）加入0.1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲赞结晶。

（3）加入150ul/孔的DMSO,摇床上低速震荡15min,使蓝色的结晶充分溶解后，在酶标仪上在OD值490nm处检测

（4）计算细胞成活率，绘制细胞生长曲线。 2.7 细胞形态观察并记录

利用倒置相差显微镜观察生长过程中细胞的形态，并拍照记录。 2.8 CCK8、MTT检测关黄柏血中移行成分抗前列腺癌活性

2.8.1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000

孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.8.2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，每孔0-10ul，设3-5个复孔

2.8.3.每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200微升，则需加入20微升CCK-8

溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

2.8.4.在细胞培养箱内继续孵育1小时、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后 选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。 2.8.5.在450nm测定吸光度。进行数据分析。