练习26：基因工程的基本操作程序 冯小勇

2016～2017学年度高二生物（选修）随堂练习二十六

基因工程的基本操作程序

组卷：冯小勇 审核：陈红霞

班级 姓名 学号

1、基因工程的基本操作程序

科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示：

上述抗虫棉的培育是通过基因工程实现的，涉及到具体操作的四个步骤，每个环节中重要考点总结如下。

1. ，实施基因工程的第一步 ①基因文库、基因组文库、cDNA文库概念及关系。

说明：基因组文库含有一种生物的 基因，而cDNA文库指含有一种生物的 基因，二者都是基因文库。 ②目的基因与标记基因的区别 ③获取目的基因的方法：

a．从供体细胞直接获取；b．从 获取；c．利用 反转录形成；d．利用PCR扩增技术；e． 。

④PCR技术

原理：DNA复制仪器：PCR扩增仪过程：目的基因DNA 后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在 作用下进行延伸，如此重复循环多次 条件： 、 、 、 、 、适宜pH和 ,结果：产生大量目的基因 个。

2． ，基因工程的第二步

①载体与表达载体的区别：二者都有 和 两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了 、 、 三部分结构。

②用到的工具酶：既用到 切割载体，又用到 将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是 。

3．将目的基因导入受体细胞 ①导入受体细胞的方法：

a．导入植物细胞的三种方法及实例， 、 、 b．导入动物细胞的方法及常用细胞， c．导入微生物的方法及处理过程， 4．目的基因的检测和鉴定

①检测是否导入。通过载体上的 进行检测。如标记基因为抗青霉素基因，则将导入后的受体细胞转移到含有 的培养基上，能存活的证明导入成功，未导入的细胞会被青霉素杀死；

②检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,方法是 ； ③检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是 ； ④检测目的基因是否翻译出了蛋白质，方法是 ；

⑤生物个体学水平鉴定，如抗虫棉是否有抗虫特性；方法是 ； 注意问题：

1．基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因 2．启动子、终止子对于目的基因表达必不可少

3．目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去 4．表达的含义：控制合成相应的蛋白质

2、基因工程的基本操作中需注意的问题

①只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对；列举其余三个步骤涉及碱基互补配对情况； 。

②操作工具有三种，但工具酶只有两种；限制酶操作步骤第1、2步中用到而且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在第2步中用至4；第2步中共用到两种酶。 ③注意标记基因和目的基因的区别；载体和表达载体的区别。

④DNA连接酶和DNA聚合酶的区别与联系：二者都是作用于磷酸二酯键，与氢键形成无关。DNA连接酶在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而且把双链上两个缺口 ：而DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，且在单链上进行操作。

三、巩固练习

1.（多选）下列关于基因工程技术的叙述，错误．．

的是（ ） A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因

D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达

2. （多选）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（ ）

A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与

B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异

3.（多选）利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是（ ）

A、过程①需使用逆转录酶

B、过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因 C、过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备

D、过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞

4.下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”示意图，使得该工程菌能大量生产人生长激素。若所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：

(1)人工获得目的基因的途径一般有哪两条?

(2)如何将目的基因和质粒相结合形成重组质粒(重组DNA分子)?

(3)目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高。导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质

粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。此处可通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够

生长的就是导入了质粒A或重组质粒。反之则没有。使用这种方法鉴别的理由是_____________________________________________________________________________。

(4)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是_______________________________________________________________。原因是____________________________________________________________________________。 (5)导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么?

5．HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：

（1）用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，可先提取HIV中的 ，以其作为模板，在 的作用下合成 。获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。

（2）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是 。该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是 。

（3）已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分 细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。 （4）人的免疫系统有 癌细胞的功能，艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。

例2、（1）反转录法 mRNA 单链DNA 双链DNA 化学合成法

蛋白质中的氨基酸序列 mRNA中的碱基序列 DNA中的碱基序列 目的基因 （2） ① 用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个黏性末端的切口

② 用同种限制酶切割目的基因，使其出现一个相同的黏性末端

③ 将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目

的基因结合成重组质粒。

（3）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因 （4）有的能生长，有的不能生长

普通质粒A上有抗四环素基因，所以导入普通质粒A的细菌能生长；而目的基因插在抗四环素基因中，结构被破坏，所以导入重组质粒的细菌不能生长。

（5）受体细胞通过转录、翻译过程合成出相应的蛋白质，即人的生长激素 【答案】（1）RNA 逆转录酶 cDNA（或DNA） （2）抗体 抗原抗体特异性结合 （3）T（或T淋巴） （4）监控和清除

【解析】（1）HIV属于逆转录病毒，它的遗传物质是RNA，在逆转录酶的作用下可以逆转录为cDNA，用于构建基因表达载体，从而制备HIV的某蛋白。

（2）HIV的某蛋白作为抗原进入机体后，能刺激人体产生针对该抗原的一种特殊的分泌蛋白——抗体；可用该抗体进行抗原—抗体进行杂交来检测血清中是否含有HIV。

（3）HIV病毒营寄生生活，寄生在T淋巴细胞内，T细胞参与体液免疫和细胞免疫，因此少了T细胞，特异性免疫几乎全部丧失，降低了机体的免疫功能。

（4）人体的免疫系统具有防卫、监控和清除的功能，可及时清除体内产生的癌细胞，艾滋病患者的整个免疫功能缺陷，机体会发生一系列顽固性机会感染和肿瘤的发生。