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实验十一、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞

【实验目的】

掌握质粒转化大肠杆菌的方法。 【实验原理】

大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。 【器材与试剂】

1．实验仪器 培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯 2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min； LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。

3.实验材料 E.coliDH5α，pUC18质粒 【实验步骤】

1、取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min待其完全溶解。

2、在超净工作台，将酶连产物加入装有感受态细胞的离心管，从超净台中取出，置于冰上静止30min。

3、42℃热激90s，时间一定要准确，迅速转入冰上静止2min以上。

4、在超净工作台，加入1mL不含任何抗生素的LB液体培养基，在摇床中37℃，180 rpm培养1h。

5、室温下，置于高速离心机中，4 000 rpm离心5 min。在超净工作台弃上清，留100μL。吹打均匀，涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基上。 6、在37℃恒温培养箱内将培养基倒置，过夜培养。 【实验结果】