酶工程实验论文

1.2.5 α-淀粉酶活力的测定

取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml 1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1ml pH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试验管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，向对照管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶活后准备下步测定。

取出以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2ml，分别放入具塞刻度试管中，再加入2ml3,5-二硝基水杨酸混匀，置沸水浴中准确5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用722型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶活性。

酶的相对酶活是指在同一组试验中，以活性最高的一组为100，其余的酶活力与之相比，计算百分数。

酶的固定效率=（固定化酶的活力/加入的总酶活力）×100% 1.2.6 单因素试验确定固定化酶固定方法

以固定化酶的相对酶活为考察指标，探讨海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度和交联时间对固定化酶活性的影响。①不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响。当氯化钙浓度为4％，戊二醛浓度为2％，交联2 h，考察不同浓度的海藻酸钠（1％、2％、3％、4％、

5%）对固定化酶活性的影响。②不同浓度氯化钙对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，戊二醛浓度为2％，交联2 h，考察不同浓度的氯化钙（2％、3％、4％、5％、6%）对固定化酶活性的影响。③不同浓度戊二醛对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，氯化钙浓度为4％，交联2 h，考察不同浓度戊二醛（3％、4％、5％、6％、7%）对固定化酶活性的影响。④不同交联时间对固定化酶活性的影响。当海藻酸钠浓度为2％，氯化钙浓度为4％，戊二醛浓度为2％，考察不同交联时间（0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h）对固定化酶活性的影响。

1.2.7 游离酶固定化后性质的对比

通过单因素实验分别确定了游离酶和固定化酶的最适pH、最适底物浓度、最适反应温度，并进行了比较

①最适pH 取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml 1mg/ml的游离酶液。前5只试验管分别加入1ml pH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的柠檬酸缓冲液，向对照管加入1ml pH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再向各试管加入40℃下预热的1%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。

②最适底物浓度 取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml 1mg/ml的游离酶液。向6只试管分

别加入1ml pH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试验管加入40℃下预热的浓度为0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%的淀粉溶液2ml，向对照管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。

③最适反应温度 取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml 1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1ml pH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即将各试验管分别放入35℃，45℃，55℃，65℃，75℃水浴中，将对照管放入40℃水浴中，准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶的活性后测定酶活。

固定化酶的试验方法是将上述方法中的α-淀粉酶溶液替换为等游离酶量的固定化酶颗粒，其余条件不变进行试验。

2 结果与分析

2.1 固定化α－淀粉酶载体选择

本实验拟采用卡拉胶和海藻酸钠作为载体对α-淀粉酶进行固定化，但在实验进行中发现，用卡拉胶对α-淀粉酶进行包埋时，随着

卡拉胶浓度的提升，其凝结温度也随之提高，当配置卡拉胶浓度为2.5%及以下进行包埋时，其凝结温度可以控制在65℃以下，但在该浓度下，固定化酶无法成球，在滴入氯化钾溶液后呈絮状，很难提取出来；当配置卡拉胶浓度为3%及以上时，为保证不凝结需保持温度在80℃及以上，此时酶活性会明显降低，且在固定化过程中很容易凝结在针管中，导致卡拉胶难以挤出，因此，我们选用海藻酸钠进行α-淀粉酶的固定化。

2.2 固定化α－淀粉酶的单因素试验

2.2.1 不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响

分别取浓度为1％、2％、3％、4％、5%的海藻酸钠溶液进行试验，结果见图1由。图1可知，随海藻酸钠浓度的升高，固定化酶火星随之升高，当海藻酸钠浓度为3％时，固定化酶活性最大，当海藻酸钠浓度继续增大时，其黏度增大，难以挤压成球状，并且所形成的凝胶小球体积过大，影响酶与底物充分结合。

图1 不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响