学位论文4 - 图文

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②梯度浓度酒精脱水（70%、2h；85%、2h；90%、2h；95%、2h；无水乙醇、1h×2次）。③二甲苯置换组织中的酒精（30min×2次）。④浸蜡（2h×2次）。⑤60℃熔点石蜡包埋，切片（切片厚度为5μm），60℃过夜烘片。苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin stain，HE stain）：①脱蜡复水（二甲苯脱蜡10min×2次，无水乙醇洗去二甲苯1min×2次，95%、90%、85%乙醇1min，水洗2min）。②苏木素染色10~15min。③1%盐酸酒精中分化8~10s。④自来水（37℃预热）返蓝10min。⑤伊红染色8~10s。⑥脱水、透明和封片（85%，90%，95%乙醇脱水各1min，无水乙醇脱水2min×2次，二甲苯2min×2次，中性树胶封片）。光学显微镜下观察各组织病理改变。根据Kuwahara T等[9,10]制定的静脉炎病理学评分方法对各组织分别进行病理评分，以衡量静

脉损伤程度，具体评分标准见下表。

小鼠静脉炎病理分级评价标准

病理观察 分级评分

血管内皮细胞脱落

无

少于血管切面1/3 1/3—2/3血管切面 多于血管切面2/3 炎细胞浸润

无

血管壁或血管周围组织少量炎细胞 血管壁或血管周围组织许多炎细胞 血管外组织中有弥漫和堆积炎细胞 血栓形成

无

少于血管切面1/3

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0 1 2 3 0 1 2 3 0 1

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1/3—2/3血管切面 多于血管切面2/3

2 3

2.2.3免疫组织化学染色检测

检测方法为将各组鼠尾组织进行石蜡包埋，连续切片贴于多聚赖氨酸处理后的载玻片上，62 ℃烤片2 h，按免疫组化试剂盒说明，切片进行常规脱蜡、复水，抗原修复，体积分数3%H2O2室温孵育5~ 10 min，封闭用正常山羊血清室温孵育10~ 15 min，倾去，滴加一抗，4 ℃过夜，洗涤后滴加二抗，37 ℃孵育10~15 min，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10~15 min，DAB显色剂显色5 min，冲洗，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察。以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。每个步骤间均用PBS冲洗3次，每次5 min。取每张片子10个视野的平均光密度值表示其相对表达量，每组取6个片子的平均光密度表示该组的平均表达量。采用Motic Images Advanced 3.2图像处理与分析系统。 2.3 统计学处理

使用SPSS16.0软件包处理，定量资料用均数±标准差（x±s）表示，定量资料两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

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结果

1 长春瑞滨对小鼠尾静脉血管内皮细胞的毒性作用

实验组小鼠精神差，鼠尾皮肤发红肿胀，4只鼠尾沿静脉走向出现条索状改变，局部淤血；对照组鼠尾皮肤多已恢复正常，仅见穿刺点结痂。 2 组织学观察结果

对照组除少量炎细胞浸润外，内皮细胞排列整齐，仅有1只出现血栓形成；实验组小鼠尾静脉血管腔部分内皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，部分静脉内可见血栓形成，符合药物性静脉炎的病理学改变。两组病理学评分差异有统计学意义（P<0.05）（见表1，图1）。

3 长春瑞滨对小鼠尾静脉血管内皮细胞TLR4表达的影响

对照组TLR4主要表达于毛囊与骨骼肌组织，血管内皮未见或仅见极低水平TLR4表达；实验组小鼠尾静脉血管内皮细胞TLR4表达较对照组明显增加（P<0.001）（表2，图2，图3）。

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第二部分

Toll样受体4在长春瑞滨致人脐静脉内皮损伤中

的作用研究 材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂和酶 总RNA提取试剂Trizol M-MLV反转录酶 EBM-2 medium

EGM-2 MV SingleQuot kit 长春瑞滨

荧光定量PCR试剂盒（Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG） MOG多肽

（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK） Human Plasma Fibronectin 兔抗小鼠TLR4多克隆抗体 1.2 引物

荧光定量PCR中所使用引物由Invitrogen公司合成，具体引物序列如下：

引物序列（5’-3’）

基因

上游引物

下游引物

美国Invitrogen公司 美国Invitrogen公司

美国Lonza公司 美国Lonza公司 美国Sigma公司 美国Invitrogen公司

美国Invitrogen公司合成

美国Millipore公司 美国Bioworld公司

TLR4 AAGCCGAAAGGTGATTGTTG CTGAGCAGGGTCTTCTCCAC

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