CLSI临床微生物实验室标准解1

CLSI临床微生物实验室标准解读

葡萄球菌

CLSI 临床微生物实验室标准解读 第一辑

2009年CLSI (M100-S19)中葡萄球菌属药敏更新部分 中国医学科学院北京协和医院 王辉 陈宏斌

2009年CLSI在版式上的显著变化是将K-B法和MIC法放在同一个表格中，方便比较。对于葡萄球菌属，主要有以下更新和变化：一是去除凝固酶阴性葡萄球菌苯唑西林纸片扩散法试验；二是删除了万古霉素纸片扩散法的药敏折点；三是增加了金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的检测。

一、β-内酰胺类的变化

2009年CLSI指出在报告青霉素对葡萄球菌敏感之前，即当MIC≤0.12μg/ml或抑菌圈直径≥29 mm，需要做可诱导的β-内酰胺酶试验。其操作如下：将分离菌株传种至血平皿或MH琼脂上，贴上作为诱导子的苯唑西林或头孢西丁纸片，35℃孵育16-18h，挑取抑菌圈边缘的细菌做b-内酰胺酶试验。b-内酰胺酶试验阳性可以预测青霉素、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林耐药。

在检测MRS时，金葡菌、路登葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)对苯唑西林的折点和选取的药敏方法有所不同，具体见表1(见下页)。在CoNS(除外路登葡萄球菌以外)中，由于苯唑西林纸片扩散法存在太多假―R‖，所以此法被去除，而是采用头孢西丁纸片法、苯唑西林/头孢西丁MIC法检测mecA介导的苯唑西林耐药。 对于由CoNS(除外表皮葡萄球菌)引起的严重感染，当苯唑西林MIC值在0.5-2μg/mL之间时，应当检测该菌株是否产mecA基因或PBP2a(图1)。利用头孢西丁检测mecA 介导的苯唑西林耐药所推荐的质控菌株是金葡菌ATCC25923-mecA阴性(抑菌圈直径23-29mm)和金葡菌ATCC43300-mecA阳性(抑菌圈直径≤21mm)。

图1 CoNS*苯唑西林MIC结果报告策略

表1. MRSA的检测方法及判定折点 菌名 金葡菌 路登葡萄球菌 药物浓度 抑菌圈直径折点MIC解释标准备注 (mm) (mg/mL) S I R S I R 头孢西丁可以用 - ≥4 作苯 唑西林耐药检测 - ≤2 - ≥4 的替 代药。根据头孢 ≤4 ≥8 西丁 - (头孢西 - (头孢西的结果报告苯唑丁) 丁) 西林 敏感或耐药 - ≤0.25 - ≥0.5 ≤24 - - - 1mg苯唑西 ≥13 11-12 ≤10 ≤2 林纸 1mg苯唑西 - 林 - 金葡菌、路登葡 30mg头孢西 ≥22 - 萄 丁 球菌 CoNS(除外路登葡 1mg苯唑西林 - 萄球菌) - CoNS(除外路登 30mg头孢西 ≥25 - 葡 丁 萄球菌)

二、糖肽类耐药性的检测

2009年CLSI推荐采用MIC法检测所有葡萄球菌对万古霉素的敏感性，去除了纸片扩散法。这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的葡萄球菌。图2显示采用Etest测定万古霉素对金葡菌的MIC为8mg/ml，为―I‖，而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为17mm，为―S‖。万古霉素纸片扩散法仅仅对于检测含vanA的金葡菌(VRSA)是可靠的。如果抑菌圈直径≥7mm，需要检测万古霉素的MIC值。对万古霉素MIC值升高的金葡菌(MIC ≥4mg/mL)和CoNS(MIC≥8mg/mL)需要送往参考实验室进一步确证。目前的研究没有重新评估替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能否将替考拉宁中介、耐药的葡萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。

2009CLSI明确指出采用含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂筛选万古霉素MIC≥8mg/ml的金葡菌，具体步骤如下：制备含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂，将待测菌株调整到0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取10ml菌悬液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿棉签并拧干多余的液体，在制备好的琼脂板上点种直径10-15mm的面积，35±2℃空气孵育24小时，>1个菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏感性下降金葡菌。进一步的试验是用确证的MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的MIC值。BHI琼脂筛选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金葡菌，一些万古霉素MIC为4mg/ml的金葡菌不能在

琼脂板上生长。推荐的质控菌株是粪肠球菌ATCC29212(敏感)和粪肠球菌ATCC51299(耐药)。

异质性万古霉素中介金葡菌(hVISA)是指子代中含万古霉素MIC值8-16mg/ml的细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA可能造成万古霉素治疗失败。采用标准的万古霉素MIC试验，一些hVISA的MIC值在1-2mg/ml之间，CLSI中还没有检测hVISA的特异方法。

图2 采用CLSI M100-S18万古霉素纸片扩散法折点，将―I‖金葡菌错误地判断为―S‖(此图片来自Janet Hindler教授的幻灯片)

三、达托霉素药敏试验

CLSI规定采用肉汤稀释法检测达托霉素MIC值，使用的培养基是CAMHB，需要将Ca2+调整至50mg/mL。葡萄球菌属对达托霉素的MIC折点只定义敏感范围(≤1mg/mL)，目前没有中介和耐药的折点。菌株MIC值高于敏感折点被定义为不敏感(nonsusceptible)。实验室如果碰到达托霉素不敏感株，需要重新鉴定菌株和检测药敏，然后送往参考实验室进一步确认。 2009年CLSI指出纸片扩散法检测达托霉素不可靠，琼脂稀释法用于达托霉素还没有被批准。 四．金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的筛选

莫匹罗星属于pseudomonic acid类抗生素，主要用于皮肤感染(如脓疱病)治疗和金葡菌鼻腔定植的清除，不需要常规检测药敏，仅仅在特别必要时检测。2009年CLSI提出要筛选金葡菌对莫匹罗星的高水平耐药(见表2)。研究表明莫匹罗星对金葡菌MIC≥512mg/mL，与定植不能清除相关。虽然此文件没有定义莫匹罗星敏感性的具体折点，但纸片扩散法和MIC筛选法可以鉴定莫匹罗星MIC值≥512mg/mL菌株。 表2 金葡菌莫匹罗星高水平耐药筛选试验 纸片扩散法筛选 200mg莫匹罗星纸片 MHA，35℃空气孵育24h 无抑菌圈：高水平耐药 有抑菌圈：非高水平耐药 MIC筛选 单孔-256mg/ml 微量肉汤稀释法，35℃空气孵育24h 生长：高水平耐药 不生长：非高水平耐药 ATCC29213–mupA阴性 金葡菌ATCC25923 (200mg纸片)–mupA阴性(抑 金葡菌(MIC0.06-0.5mg/mL) 菌圈直径29-38mm) 金葡菌ATCC BAA1708–mupA阳性(无抑菌圈) 粪肠球菌ATCC29212–mupA阴性(MIC16-128mg/mL) 金葡菌ATCCBAA1708–mupA阳性(不生长)