引物设计

与Ⅱ的结果输出一样有四种格式：

Table： Motif的位置，数量。

SEQ： 整段序列及Motif的位置。

MAP： 与上一项近似。 用示意图的方式显示结果。

Motif absent： 序列中不存在的Motif。

3．我个人感觉，先用RNA structure模拟一下mRNA结构，选择非发夹结构区，再用Primer Premier 5.0设计引物，设计出来后再用oligo验证一下，这样最保险！

不过万一不行的，RNA structure只能是个参考，不要全信，否则很难设计引物

而且Primer Premier 5.0有时对antisense的能否有配对等识别不清，oligo可靠！

4．1 如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

2． 如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

3． 怎样按照使用浓度溶解引物？

记住几个参数：

在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的溶液定义为1 OD260单位，据此定义，1 OD260引物干粉约为33微克；

碱基的平均分子量为324.5；

引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；

引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量

举例：如果您拿到一管标明为2 OD的20碱基的引物，

分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg

摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol

若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。

同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。

4． 如何保存引物？

可以室温或-20℃密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH值要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。

5． 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。

6． 为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

7．引物不纯会造成什么后果？

引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。

8． 普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗？

普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基，可直接用于PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费(参见价目表)。

9. 常用标记的荧光染料的波长、可见光中的颜色

简称 全称 吸收波长 发射波长 颜色

6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green

TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange

HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink

TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose

ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red

Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red

Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet

from:http://www.lookgene.cc/useful.htm

5．计算机辅助引物设计 from:http://www.augct.com/Chinese/technic/primerds.htm

引物在PCR反应中处于关键作用，引物决定着扩增的特异性和扩增的效率。而在目前DNA的化学合成技术非常成熟的情形下，引物设计是否合适是我们应更为关注的层面。现在有很多的免费的软件或网络资源（http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）能辅助我们进行引物设计，这使我们总能找到适合我们自己应用的引物设计工具。笔者用得较多的引物设计软件有oligo 6.0 (http://bioinfor.cicams.ac.cn/softintro.htm)，Primer premier 5 ( www.premierbiosoft.com\TARGET=_blank www.premierbiosoft.com demo version)。

需要说明的是经过细致推敲和计算的引物并不能保证扩增一定能够成功或高效，但严密的设计并系统地考虑一些应该避免的问题，能使我们在大多数情形下找到我们所需要的引物。

笔者接触PCR较早，较多地从事引物设计也有一年多的时间，其间也得

到过许多老师的帮助指教，现将一些体会整理出来，希望能对大家有一些帮助，同时也盼望能得到更多的指点。

一，简单扩增体系中引物设计原则。

简单体系，是指扩增体系中模板较为单一且大部或全部模板序列已知，如经过纯化的短片段或纯化后的重组质粒等，是相对后面所提的复杂体系而言的一个粗略的分类。以下是一个大致的流程：

1， 考虑实验本身对这对引物的要求。如：待扩增区域和扩增产物长度，扩增产物是否需要考虑移码突变，是否需要在引物5’端引入酶切位点和引入哪些酶切位点，是否需要引入点突变，?? 依据具体的实验而定。实际上，此步应该是最费时间和精力的一步。

2， 引物的Tm值。主要需要考虑的因素有：I, 反应体系对引物退火温度的影响；如酶的最适工作温度对引物退火温度的限制等。II,扩增产物的Tm值。引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。

3， 引物的二级结构。包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于3’末端且5’端突出的引物二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端可适当放宽。发卡结构也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大，影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。 4， 扩增的特异性。好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，如Oligo 6.0 的false priming efficiency，即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出，当此值大于200时便很有可能引发扩增。如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过70%的碱基能互补配对，或引物3’末端连续8个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。

在简单扩增体系中，当我们定好上述限制条件，如能找到适合这些条件的引物，便最大可能地找到适合我们实验的引物。如不能满足上述所有条件，则按所列顺序依次满足，总的来说遵循这样一个秩序：扩增出符合实验需要的产物→扩增出能够分辨分离的符合实验需要的产物→特异地扩增出符合实验需要的产物。同样，这一先后秩序也适用于复杂的扩增体系。

二，复杂模板的扩增体系。

所谓复杂模板，是指体系中的DNA种类和数量较多，不能以此引物对所有的模板一一比较来计算其异位引发的可能性的情形。此情形下与简单模板扩增