DNA、RNA及蛋白质操作技术

总RNA的抽提方法有多种，目前实验室常用的方法是用异硫氰酸胍-苯酚抽提法。Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA的纯化。实验中还常将含有RNA样品的细胞破碎液通过一个硅胶膜纯化柱，使RNA吸附在硅胶膜上而与其它成分分开，进一步在低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，得到纯度较高的RNA。要根据不同植物组织的特点，预先去除酚类、多糖或其它次生代谢产物对RNA的干扰。

RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40 μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。

可通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA。由于RNA呈单链状态，易形成二级结构而且易降解，因此常在变性条件下进行RNA电泳。甲醛是最常用的变性剂，也可用加热方式或尿素等变性剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量RNA，电泳后如果rRNA 大小完整，而且28S rRNA和18S rRNA亮度接近2：1，mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。

5. 3. 2 mRNA的纯化

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴，这种poly（A）结构为真核生物mRNA的提取提供了极为方便的选择性标志，实验中常用寡聚（dT）-纤维素柱层析法获得高纯度mRNA。该方法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，当RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚（dT）纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。实验中常用PolyAT Tract mRNA分离系统将生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总

228

RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyA mRNA，通过磁场吸附作用将polyA mRNA从总RNA中分离（图5-18）。

5. 3. 3 cDNA的合成

cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成，整个流程如图（图5-19）所示。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligo（dT）。oligo（dT）引物一般包含12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物（通常为XhoI等酶切位点）以便于克隆构建。

在cDNA合成的过程中，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链cDNA的方向性（图5-20）。反应体系中一般加入甲基化dCTP，保证新合成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。第二链cDNA的合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成第二条cDNA的片段，再通过DNA连接酶的作用连成完整的DNA链。此时加入含有另一个酶切位点的黏性接头（如EcoRI），与cDNA相连接后用XhoI酶切，使cDNA双链5’端和3’端分别具有EcoRI和XhoI黏性末端，保证它与载体相连时有方向性。因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。

5. 3. 4 cDNA文库的构建

由于cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库的载体选择要根据该文库的用途来确定，例如常用的Uni-zap XR载体是一种λ噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段。该载体内部含有pBluescript载体的全部序列，重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。

229

含有cDNA插入片段的重组噬菌粒只有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为有侵染和复制能力的成熟噬菌体。DNA和蛋白提取物的浓度、二者的体积比、反应温度及时间对包装效果都有很大影响，而包装反应结果的好坏对重组噬菌体的侵染能力至关重要。用经包装的噬菌体感染大肠杆菌培养物后涂布在琼脂平板上，便会产生成千上万个独立噬菌斑，每个噬菌斑由一个重组噬菌体分子形成。一个比较完整的cDNA文库常包含大于5×105的独立克隆。一旦获得含有某种组织器官cDNA信息的噬菌粒文库，就可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。

5. 3. 5 基因文库的筛选

基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。主要筛选方法包括核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法等。

1．核酸杂交法

核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的方法之一，常用放射性标记的特异DNA探针进行高密度的菌落杂交筛选（图5-21）。将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，进行适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。在X光底片上显黑色斑点的就是实验中寻找的目的克隆，可以通过对应于平板上的位置找到相应克隆。

也可用杂交筛选法进行重组噬菌斑的筛选。将硝酸纤维素膜覆盖在琼脂平板表面，使之与噬菌斑直接接触，噬菌斑中大量没有被包装的游离DNA及噬菌体颗粒便一齐转移到膜上。可从同一噬菌斑平板上连续印几张同样的硝酸纤维素膜，进行重复实验，而且可以使用两种或数种不同的探针筛选同一套重组子，提高结果的可靠性。

230

2．PCR筛选法

PCR筛选法与核酸杂交筛选法具有同样的通用性，而且操作简单，但前提是已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。例如要从一个基因组DNA文库筛选目的基因，首先将整个文库（以质粒或菌落的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。

3．免疫筛选法

由于免疫筛选法是基于抗原抗体特异性结合原理，所以该法适用于对表达文库的筛选。也就是说如果该DNA或者cDNA文库是用表达载体构建的，每个克隆都可以在宿主细胞中表达，产生所编码的蛋白质，就可以用免疫筛选法进行筛选。即使实验中靶基因的序列完全未知，只要拥有针对该基因产物的特异性抗体，也能用这个方法进行筛选。

免疫检测与菌落或噬菌斑的核酸杂交相似，先将菌落或噬菌斑影印到硝酸纤维素膜上，原位溶解菌落释放抗原蛋白，再用抗体与固定了抗原的膜杂交，抗原抗体结合后，再用标记的二抗与之反应，通过对标记物的检测，就可以找到阳性克隆（图5-22）。

5. 4 基因克隆技术

在当今生命科学的各个研究领域中，“克隆”（clone）一词已被广泛使用。在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体，所以说，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。由于真核生物基因组DNA十分复杂，实验中常通过筛选由mRNA产生的cDNA文库来分离到目的基因片段。高等生物虽然可拥有3-5万种左右不同的基因，但在一定时间段的单个细胞或组织中，仅有15%

231