RNA干扰的研究进展

RNA干扰的研究进展

摘要：RNA干扰是生物体的一种在进化上高度保守的，能抵御外源基因或外来

病毒侵犯的重要防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默现象。它由双链RNA引发，广泛存在于动植物等各种生物体内。本文介绍了RNAi的发现、分子机制、特点、载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用及前景。

关键词：RNA干扰；双链RNA；转录后水平的基因沉默；小干扰 RNA Abstract: RNA interference is a important defense mechanism to withstand

exogenous genes or foreign viral invasions. It is highly conserved in biological evolution and a phenomenon of sequence-specific post-transcriptional gene silencing. It is caused by the double-stranded RNA which is widely found in animals, plants and othercreatures. This study aimed to introduce the discovery of RNA interference, molecular mechanism, the method of forming a transgene carrier and wide application prospects of RNAi in life sciences.

Key words: RNA interference; Double strand RNA; Post-transcript gene silencing;

Small interfering RNA

RNA干扰(RNA interference,Ai)是指通过内源性或外源性双链RNA(double

strand RNA,dsRNA)的介导，特异性降解相应序列的mRNA，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能型缺失的现象，属于转录后水平的基因沉默(post-transcript gene silencing,PTGS)现象[1]。RNAi是广泛存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA的一种保护机制，同时在生物生长发育中扮演着基因表达调控的角色,使人们重新认识了RNA在基因信息流控制过程中的重要性[ 2 - 3 ]。细胞内双链RNA在酶的作用下，形成20-25碱基大小的小干扰RNA(siRNAs)，由siRNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，抑制该基因在细胞内的翻译表达,目前RNAi的作用机制已经基本明确，并显示出广阔的应用前景。

1 RNA干扰的发现

康乃尔大学的Su在试图阻断秀丽线虫中的Par-1基因时，发现了一个意想

不到的现象。他本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，同时在对照实验中给线虫注射正义RNA期望能观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断Par-1基因的表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。1998年，Fire用纯化过的dsRNA及单链RNA进行实验，发现前者的实验结果是由于单链RNA中污染了微量的互补链导致的；只有dsRNA能够导致基因敲除型的表型，其抑制基因表达的效率比纯化过的单链 RNA至少高2个数量级，因此他们提出了RNA干扰这个概念。同年，Waterhouse证实植物中的RNA干扰也是由dsRNA介导的。

2 RNA干扰的机制

目前，有关RNAi发生机制的研究主要集中在植物和低等动物如线虫、果蝇等中，研究认为，RNAi的作用大致可分为以下三阶段。

2.1 起始阶段

dsRNA的形成阶段。外源DNA、RNA序列均可引起细胞产生相应的dsRNA。dsRNA可以是一个RNA分子回折，自身互补而形成分子内双链；也可以是分开的两个RNA分子互补形成的分子间双链。当细胞中的dsRNA扩增达到一定量时，dsRNA会在一种具有RNase活性的内切核酸酶作用下加工裂解成21～23nt由正义和反义序列组成的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNA)，每个siRNA分子互补双链两侧3'末端具有2nt的突出，5'端的磷酸基团会被一种特殊的激酶保护起来。

2.2 效应阶段

siRNA的反义链可指导形成一种核酸内切酶复合体，称RNA induced silencing complexes(RISC)。RISC是由多种蛋白成分组成的，包括：内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等，其第一个亚单位为siRNA。RISC可利用结合在其上的内切核酸酶活性切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而干扰基因的表达。在引导RISC与靶mRNA结合时，siRNA3'端倒数第2个碱基起的作用非常大，因此此处不能出现错配现象。

2.3 扩增阶段

siRNA作为引物在RNA依赖的RNA 聚合酶作用下通过类似PCR的扩增作

用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNAase样的Dicer内切酶切割产生次级siRNA，次级siRNA又可以进入下轮循环。

3 RNA干扰的特点

3.1 高序列特异性

RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19nt 的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的1nt突变后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA 非常特异地诱导与之序列同源mRNA降解，避免降解与目的mRNA 同家族的其他mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默。因此，RNAi 具有重大的医学价值。

3.2 高效性

RNAi存在级联放大效应，由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA的结合并降解后者，产生新的siRNA；可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同mRNA降解的多次利用，如此循环，使得相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能产生强烈RNAi效应，并可达到缺失突变体表型的程度。

3.3 RNA干扰的抑制作用迅速

RNAi发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。

3.4 RNAi作用的靶基因位点有选择性

外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少有影响，以内含子或启动子序列构成的外dsRNA无法引起RNAi效应。

3.5 高稳定性

与反义寡核苷酸不同，siRNA是3＇端悬挂TT碱基的双链RNA，所以化学性质很稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。

4 RNA干扰的转基因载体

RNAi转基因生物在生命科学研究中扮演越来越重要的角色，让我们不得不考虑RNAi转基因载体的构建问题。其策略主要有：利用 RNA聚合酶Ⅲ的H或

U6启动子来启动siRNA的转录，下游紧接的是能形成发卡结构状dsRNA的特定序列，然后接着polyT，有的载体还在下游加上表达荧光的报告基因，此设计由于是通过一个中间序列形成一个环引导的发卡，称为一体型载体[4]；还有一种前后型载体，采用相同的两个启动子，一前一后分别启动siRNA正义链和反义链的转录[5]。利用RNA聚合酶Ⅲ构建的载体设计的siRNA一般长度为 21～23个碱基。这种载体dsRNA长度能达到500个碱基以上，由于产生的dsRNA不进行5′端加帽和3′端加尾，所以不能被转运出核而滞留在核内。这种长链dsRNA经过核内Dicer降解成小RNA，然后被转运出核与特异的mRNA结合，导致靶序列的降解[6]。

然而，在转基因植物和转基因动物研究中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称基因沉默( gene silencing)[7]。一般认为基因沉默有3种情况：位置效应基因沉默、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默。那么如何来避免基因沉默呢？要从载体的构建策略上出发：① 避免外源基因与内源基因的同源性过高；② 采用甲基化酶活性较低的受体细胞；③ 尽量采用外源基因是单拷贝的转基因动物。

5 RNA干扰的应用

5.1 研究基因功能

可以利用RNA干扰技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞乃至生物体从形态到各项生理生化的变化来推导该基因的功能。Andrew等[8]用可分泌dsRNA的细菌喂养线虫，研究了染色体Ⅰ约90%的预测基因，13.9%的基因与其功能对应起来，使已知表型的基因数目由70增至378;袁婺洲等[9]分别将果蝇心脏发育基因tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎，得到了这两个基因的dsRNA干扰表型，与两个基因的突变体表型非常相似，都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失，尤其是tinman基因的dsRNA，还引起了肠中胚层缺失和体壁肌肉组织的紊乱，而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成，而不影响肠中胚层，说明dsRNA干扰具有非常强的特异性。目前通过RNAi已搞清楚了包括果蝇、线虫和一些植物的基因的功能。在哺乳动物基因功能研究方面，Tuschl实验组将体外构建的siRNA分别导入Hela细胞（人类宫颈癌细胞）、大鼠成纤维细胞和小鼠3T3细胞，分别抑制了lamin