分子生物学实验步骤

细菌的活化及培养

1.将实验室用到的烧杯、锥形瓶、培养皿等实验器皿用超声机超声20min，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗干净，放入烘箱中烘干。

按照培养基成分配置液体培养基，分别调好pH值后,然后进行灭菌30min。

牛肉膏蛋白胨培养基配方

Pepton （蛋白胨） 0.25 g Beef extract （牛肉膏） 0.15 g NaCl 0.25 g Distilled water （蒸馏水） 50 mL pH 7.0-7.2 接种：在超净工作台中，取1 mL的菌种加入液体培养基中，混匀，37℃恒温振荡培养12h。

2.菌种的保存（采用甘油保藏法）

先取800uL的菌悬液于1.5mL的无菌离心管中，再加入200uL的灭菌甘油，用封口膜将离心管口封号，以上操作均在超净工作台中完成，然后将装有甘油和菌悬液的混合液在漩涡震荡以上混匀，保存至-78℃。

细菌DNA的提取

采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒对单增李斯特菌进行基因组DNA抽提。

操作步骤如下：

1）取细菌培养液1ml，1000rpm离心一分钟，尽量吸净上清。 2）向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第二步，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μl缓冲液（110μl TE缓冲液,70μl溶菌酶），37℃处理30min以上。

3）向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

4）加入220μl缓冲液GB(改良磷酸盐缓冲液)，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

5）加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8）向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9）向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中的残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。DNA产物应保存在-20℃，防止DNA降解。

PCR（聚合酶链式反应）

（一）、 器材准备

1、 移液枪：100微升、10微升 2、 枪头：100微升、10微升

3、 枪头盒：100微升、10微升

4、 EP管：1.5毫升、100微升（PCR薄壁专用EP管）

为避免污染，除移液枪外均需要高压灭菌，烘箱烤干。塑料制品（枪头、EP管等）高压灭菌3次，烘箱烤干；DD H2O也要高压，分装到几个EP管中可-20℃保存。

（二）、 PCR实验

请注意，要佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。预制沸水。 1、 PCR准备：准备100微升的PCR薄壁专用EP管。 2、依次在管中加入：（25ul反应体系，参考）

DD H2O 17.5 ul 10 mM dNTP 2ul 10×PCR buffer 2.5ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 模板DNA 1ul 酶 0.1ul

请注意：如果同一个样品使用多个EP管进行同样的PCR，请先按照上述顺序把所有的反应试剂总量先在一个大的EP管中预混，并留出适当的误差消耗量，再分管进行PCR。

2、 分管

3、 稍离心，使管壁上的液体流下去。

4、 PCR条件（参考！不同试验温度、时间、循环次数有所不同）

94℃ 1 min 58℃ 50 sec 72℃ 1 min 30 sec 进行30个循环， 然后72℃ 10min 4℃保温20min。

请注意：循环次数并非越多越好，30次循环一般情况下已足够。 9、 10000转离心5分钟

10、 将下层水相转入新的EP管中，-20℃保存备用，或立即进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

电泳鉴定

（一）、 准备工作 1、 实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）枪头：20ul

（3）枪头盒：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个 （5）琼脂糖

2、 实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括枪头等）

高压3次，试验前将枪头放入枪头盒（不要怕麻烦哦，这样做可极大减低污染几率）。 （2）电泳板及电泳槽： 用自来水冲洗干净备用 3、 试剂配制和准备： (1) 电泳缓冲液（TAE）：

先配制0.5mol/L，pH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na2加入160ml DD H2O蒸馏水

中，在搅拌器上剧烈搅拌。再用NaOH调节溶液pH值至8.0（约需4g NaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。

再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。 （2）琼脂糖溶液（1.0％）：

50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5 g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶

化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。

（3）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer （二）、 电泳鉴定时注意事项：

佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。

（三）、 电泳步骤

1、 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5 g琼脂糖。微波炉上煮沸。另外450ml

TAE倒入电泳槽中。

1、 用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却

后，拔出梳子，放入电泳槽中。

2、 加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混匀于塑料膜（可以

使用一次性手套）上，加入孔中。

3、 PCR样品：5ul 样品DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 4、 接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。

5、 电泳约1小时（参考）后，紫外灯检测（不同长度的目的DNA电泳时间有所不同）。