家禽日粮纤维的研究进展

高纤维日粮后对野生鹅真代谢能的影响，研究发现没有去盲肠的鹅的真代谢能是去除盲肠组的两倍[32]。所以说鹅对纤维的消化离不开肠道内的微生物，更体现出了研究肠道微生物的重要性。

2鹅肠道微生物多样性的研究进展

2.1家禽胃肠道营养与微生物区系的相互关系

肠道是动物体最大的消化器官，动物获取营养的重要手段。动物对食物的消化是酶的消化，除了某些小分子物质可直接吸收外，动物必须分泌相对于底物的酶，才能分解出其中的营养物质。如果动物不能分泌相应的酶，如分泌纤维素分解酶，动物体就不能对纤维素进行消化利用。家禽能利用一定比例的纤维素[1]，但自身并不能分泌半纤维素分解酶与纤维素分解酶，有趣的是家禽的肠道中却可以检测出这种酶。研究发现这种酶来自动物肠道中能分解纤维素类物质的细菌，细菌分解纤维素得到的营养物质部分被家禽吸收利用。另外，肠道还是动物体重要的免疫器官，家禽胃肠道的健康得益于家禽胃肠道微生物区系的存在与平衡。微生物菌群在肠道内定植，与宿主形成共生的营养关系，定植后的正常的微生物菌群对其他细菌会有有效的抑制作用。肠道内的各类菌在一起形成一个平衡共同占据肠粘膜形成一个生物学屏障，是主要防止家禽受细菌感染的原因。由此可见动物的胃肠道营养离不开肠道微生物。

2.1.1家禽肠道微生物区系

家禽的肠道微生物系统是由细菌组成的多种群的有机整体[2]。家禽肠道微生物区系的形成是个发展的过程，家禽出壳的第1天，肠道几乎没有微生物，出生后不久就有微生物不断侵入，受到母体与外环境的影响直到形成复杂而稳定的微生物区系。Mead（1975）在0-4日龄的鸡盲肠中检测到以大肠杆菌、肠球菌为主的菌群[3]。崔秀艳等（2008）研究发现雏鹅出生肠道是无菌的，6小时后腺胃中检测出细菌，随后大量需氧和兼性厌氧菌繁殖，然后出现厌氧菌的繁殖高峰，并46日龄是细菌完成定植过程，在盲肠中检测出优势菌有葡萄球菌、真杆菌、消化球菌、双歧杆菌等[4]。小肠中微生物群落大约需要2周建立起来，盲肠微生物群落的建立则要6-7周。40天以后，肠道微生物群落开始稳定下来，主要由

粪链球菌、大肠埃希氏菌、拟杆菌和乳酸菌组成。

2.1.2胃肠道微生物区系和宿主之间的关系

Hooper等[8]将微生物与寄主的关系分为互利共生(symbiosis)、同食共生(commensal)及致病(pathogenic)3种。互利共生就是微生物寄宿在寄主内，双方都不会危害对方，且双方受益。同食共生是指仅共生而对宿主无营养作用，还会与宿主竞争营养。致病关系是指具有致病性的细菌导致宿主生病，但是正常微生态失衡也会使宿主致病。胃肠道微生物区系的关键性生理功能包括保护粘膜上皮损伤，调节脂肪的储存，刺激肠道血管生成和竞争拮抗致病菌的定植。

肠道菌群对动物的营养作用主要体现在肠道菌群能提高机体免疫机能，能建立起屏障作用。正常的肠道菌群在肠粘膜表面形成一个生物学屏障，阻止了致病菌的定殖和入侵，对胃肠道起重要的保护作用。王世荣等（1989)试验得出，无菌鸡回盲部的淋巴结比普通鸡小4/5，发现无菌动物的体液免疫、细胞免疫功能均低于普通动物[14]。胃肠道微生物区系还可以促进营养物质的消化，能通过分泌营养素提供营养给宿主，为宿主提供维生素、氨基酸和短链脂肪酸。王志跃等(2004)认为鹅对植物纤维的消化和利用多依靠消化道中寄生的微生物完成。

肠道菌群的负营养作用主要是它能诱发感染、对肠道有腐烂和产生毒素作用，但致病性细菌数量少，不会致病，是保持微生物生态平衡中不可缺少的部分，在数量超过一定水平时即会致病，还有些菌群具有潜在致病性。另外，肠道微生物会利用损耗掉一部分的饲粮营养物质。

2.2影响畜禽肠道微生物的因素

畜禽肠道微生物群组成虽然比较稳定，但是受饲料、饲养环境和饲养方式等因素的影响而发生变化[5]。由于不同种类的细菌所需要的底物和生长条件不同，所以饲料日粮的化学成分在很大程度上决定了肠道微生物菌群的种类。因此，日粮成分和营养浓度的变化对肠道微生物菌群的的组成和数量产生影响(Gibson等，1996[15]；Hillman，1999[16]；Reid和Hillman，1999[17])。在饲料中添加抗生素、益生素、益生元、合生元、铜锌以及改变日粮组成和饲喂方式等[6]，对肠道微生物区系的结构和多样性产生直接影响。另外，日粮成分和肠道菌群以

及它们的相互作用会影响肠道发育、粘膜结构以及肠道分泌粘液的成分。所以说肠道微生物的演化与动物肠道微环境的变化是一致的，是生物与环境共同进化的结果。Lan等（2005)也指出日粮纤维水平的改变，会导致肠道微生物菌群的变化。刘记强

（2009)与刘蓓一（2012）研究都指出，纤维水平的不同对鹅的盲肠菌群起主要的作用，对其他肠道没有影响，且随着纤维水平的提高，盲肠中微生物的种类也增加。Dunkley等（2007)证明饲喂苜宿这种高纤维、低能量的饲料可以给鸡盲肠提供更充分的微生物发酵作用,形成挥发性脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸，从而抑制沙门氏菌的增殖[59]。Varel等用不同纤维素来源和不同水平纤维日粮饲喂生长猪和成年猪98天，测定了粪样中纤维分解菌的数量。结果表明纤维分解菌的数量随饲喂时间的延长而增加，但也与纤维来源有关。胡平（200）研究发现，日粮形态显著影响肠道菌群的种类与数量，导致空肠菌群种类的下降和回肠细菌种类的增加，同时影响菌群在肠道内的分布情况，对空肠和回肠影响较大。王长文等采用稀释滴种法对0~56日龄雏鹅消化道6个部位细菌进行分离、培养、鉴定、计数，发现雏鹅消化道细菌定植过程约46日龄完成，羊草组细菌数量比玉米秸秆组少，但乳酸杆菌和双歧杆菌的相对含量比玉米秸秆组高，日龄、消化道部位和纤维源显著影响各种菌的定植规律。

2.3胃肠道微生物群体的研究方法 2.3.1传统培养方法

传统研究肠道微生物的方法是在显微镜下直接观察或是进行微生物培养计数。对肠道微生物的培养使用不同营养成分的固体培养基对其进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量和种类。稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法师分离和纯化微生物的常规方法。纯培养方法简单易行，但是也存在不少的缺陷，主要表现在固体培养基的选择和实验室培养条件等方面的限制上。利用平板培养法不可能全面地获得环境或肠道中所有或者绝大多数微生物的全部信息，只能获得环境或肠道中1%-10%的微生物[36]。平板培养法只能得到微生物类群的数量信息，若要知其种类信息，必须进一步地分离、纯化和鉴定。

2.3.2分子生物学方法

近年来，分子生物学技术的应用使得能够从遗传水平上研究微生物的多样

性。尤其是细菌16SrRNA分子技术的发展，使得肠道微生态学的研究取得了新的进展。目前应用于肠道菌群多样性研究的技术主要有16S rRNA基因序列分析技术、遗传指纹技术（PCR-DGGE技术和T-RFLP技术）、核酸分子杂交技术（荧光原位杂交技术和基因芯片技术）、实时荧光定量PCR技术（RT-PCR技术）和DNA测序技术（第一代、第二代、第三代测序技术）。其中DGGE技术、RT-PCR技术是近年来国内外研究菌群遗传多样性的重要技术。变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是由Fischer和Lerman[37]于1983年创立。1993年最先由德国的Muyzers等应用于环境微生态学的研究[38]。DGGE技术的特点是可重复性强、可靠性高、速度快，最大优点是能够显示群落中的优势种类，但也是其缺点，导致小于1%的种群难以检测到。RT-PCR技术补充了DDGE技术只能对肠道微生物定性的这一缺点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已经成功与动物肠道菌群方面的研究中。实时荧光定量PCR包括探针类和染料类，探针类特异性更高，但需要探针的识别，染料类简便易行，成本较低。基于这些技术，第二代测序技术已经取得广泛应用，但是其必须基于PCR扩增，成本、准确性等关键问题仍然存在，科学家正在致力于新的测序解决方案。目前，以单分子测序为主要特征的第三代测序技术，也称为next-next-generation sequencing，已经初现端倪。

2.3.3分子生物学方法在微生物上的应用

自1993年Muyzer首次将DGGE技术用于微生态研究以来，DGGE/TGGE技术得到了越来越广泛的应用，已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究，利用该技术对家禽肠道菌群进行分析研究也越来越多。

王金全等（2004）[7]用PCR-DGGE法研究小麦NSP和木聚糖酶对肉鸡肠道微生物区系的影响，结果表明，小麦非淀粉多糖明显降低了肉仔鸡肠道微生物的菌种数量，整个肠道微生态环境发生改变；添加木聚糖酶对肉仔鸡肠道微生物数量和微生物区系产生影响，但未达到显著水平。Hume等（2003）[52]利用DGGE技术比较生长期和换羽期来航鸡消化道微生物菌群的变化，结果表明，大于20日龄的小鸡肠道微生物菌群的相似性高于20日龄以下的雏鸡肠道微生物菌群相

似性，换羽和未换羽母鸡盲肠微生物菌群的相似性约为40%。研究证明分子基础上的DGGE技术能够监控鸡消化道细菌群落的变化。倪学勤等（2008）[53]采用PCR-DGGE技术对2、4、6和8周龄蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物细菌群落的结构和多样性进行比较，分析蛋鸡年龄和肠段部位对微生物群落结构和多样性的影响，肠道菌群DGGE图谱显示肠道部位对细菌种群结构影响很大；随着蛋鸡周龄的增加，消化道微生物经历了由简单（2周）到复杂（4周），再回复简单（6周）到复杂（8周）的动态变化过程。。VanKley等（2008）

[54

分析比较了几个农场的家禽粪便样品，结论得出，DGGE方法可以快速区分检

测家禽粪便中的艾美球虫属的种群。Najdenski等（2008）[55]优化和应用了鞭毛蛋白基因变形梯度凝胶电泳（Fla-DGGE）技术来分析肉鸡盲肠样中空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌得出，Fla-DGGE可以作为一种不依赖培养的鉴定鸡盲肠样中空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的快速方法，具有发展潜力。徐敏娟（2008）[28]探讨鹅肠道细菌多样性中得出，以DGGE 技术分离16S rRNA条带研究鹅肠道细菌多样性是可行的，她还认为DGGE相对于SSCP能更好地分离鹅肠道菌群，能更好地反应鹅肠道菌群多样性。胡平利用PCR-DGGE技术研究了玉米形态円粮对鹤肠道微生物区系的影响，与GenBank相比对后，得到扬州我鸟肠道中的优势菌主要是鹤肠球菌、链球菌、罗氏菌、金黄色葡萄球菌等。刘蓓一（2012）应用了DGGE技术及荧光定量PCR技术研究了不同纤维水平对扬州鹅仔鹅肠道微生物区系的影响。

3 本试验的研究目的与意义