建立HPLC用于双黄连口服液中黄芩苷的含量测定以及方法学验证

建立HPLC用于双黄连口服液中黄芩苷的含量测定以及方法学验证

1040314 潘明

对原实验选用方法进行改进的原理：

黄芩苷有两个最大吸收波长，分别为278nm和315nm，因为双黄连口服液中另一主要成分绿原酸的最大吸收波长为326nm，为保证得到良好峰形，仍采用278nm为检测波长。黄芩苷为黄酮类化合物，有多酚羟基结构，在低温和酸性条件下稳定，一般将pH控制在3-4之间。原实验用冰醋酸调节pH，但醋酸有易挥发不稳定的缺点，所以改用0.4%的磷酸溶液（低浓度减少磷酸盐对色谱柱的侵蚀），流动相为甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ）。

改进后实验条件:

色谱柱：C18(250mmX4．6mm，5μm )； 流动相：甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ） 流速：1.0ml/min 进样量：20μl 柱温：室温

理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于1500

样品含量的测定方法：

取样品溶液，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

方法学验证：

1.专属性实验

空白溶液：甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ） 黄芩苷对照品溶液制备：精密量取黄芩苷对照品适量，精密称定，制 成0.1mg/ml溶液

供试品溶液：精密量取双黄连口服液1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声波处理20min，放置至室温，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，

即得

不含黄芩苷的阴性对照供试品溶液制备：原则上需要，制备复杂，本实验不做

取上述溶液分别进样，测定，观察在相同位置上是否有与标准品溶液对应的峰，表明空白对照无干扰

2 回收率实验

取制得的供试品溶1ml置于10ml容量瓶中，共6份 。精密量取黄芩苷对照品0.013g，0.016g和0.019g各两份，分别加入上述6份溶液中，依法测得其含量，并计算回收率。（加入的标准品一般为供试品含量的80% 100% 120%）

加样回收率=（测得量-本底量）/加入量 ×100%

3.线性范围考察

精密量取上述黄芩苷对照品溶液1，2，3，4，5，6m1分别置于lOml量瓶中，加5O% 甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别取20μl进样，记录色谱图。以峰面积y对对照品进样量(mg/ml)线性回归，得黄芩苷标准曲线。

4 精密度实验

（1）进样精密度：取供试品溶液20μl，重复进样6次，计算RSD （2）重复性：精密量取同一批号样品6份，按样品溶液的制备方法，分别配置供试品溶液，测定黄芩苷的含量，计算RSD。

（3）中间精密度：取同一批样品，甲乙两个操作员在两台不同的一起上分别独立操作，计算RSD（一般仅在报批时测定，本实验不做）

5.检测限与定量限

信噪比3：1测检测限，信噪比10:1测定量限

6.供试品稳定性实验

取重复性实验中的第一份溶液，室温下在0，3，6，9，12 小时测定，结果表明，本品的供试品溶液在室温12小时内基本稳定

7.重现性实验

在不同的实验室，不同的工作人员，不同的仪器，不同的化学试剂来源的条件在测定（一般仅在报批时测定，本实验不做）

8.耐用性实验

改变流动相的组成，流速和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温。考察条件改变对分析结果的影响及影响大小（本实验不做）