甲基化检测

图2：甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图。DNA 经重亚硫酸盐处理后，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物（primerⅠ）或非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增（如图所示），只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。

这种方法的优点是：1.避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题；2.敏感性高；可用于石蜡包埋样本[12]；缺点是：1.要预先知道待测片段DNA 的序列；2.引物设计至关重要；3.若待测DNA 中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂；4.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；5.存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。

2.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）

Gonzalgo and Jones 1997年提出了结合重亚硫酸盐处理和单核苷酸引物延伸（Kuppuswamy等1991年提出[29]）的Ms-SnuPE方法[30]，用于定量检测已知序列中特异位点的甲基化水平。过程是：先将研究序列用重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms-SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C/T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化

情况[5][29]（见图3）。同理也可以用dGTP或dATP。而且，若需研究一条链上不同位点CpG甲基化情况，可通过设计不同的引物在同一反应中完成[12]。

图3: 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（Ms-SnuPE）示意图。DNA 经重亚硫酸盐处理后，以PCR扩增后得到产物作为Ms-SnuPE延伸的模板，于反应体系中入设计好的引物和同位素标记的dCTP或dTTP进行甲基化特异的单核苷酸引物延伸，随后，电泳分离、测定同位素放射活性，确定甲基化水平。

这种方法的优点：1.可以了解特异位点甲基化情况且不受内切酶的限制；2.通过设计的不同引物在同一延伸反应情况可以了解不同位点CpG甲基化的状况；3.可以检测出样本序列中分布不均匀的甲基化位点；4.是一种能够用于定量检测甲基化水平的方法；5.仅需少量的DNA 样本，可以用于石蜡包埋样本的测定。缺点是：1.实验步骤略复杂，若要检测多个位点时则需设计多个引物[5]；2.存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。

2.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）

Xiong and Peter报道了COBRA[31]甲基化检测法。这种方法对标本DNA 行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA 的甲基化状况。（见图4）。

图4： 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）示意图。重亚硫酸盐处理DNA 后行PCR扩增，用限制性内切酶(BstUI）识别转化后序列中的酶切位点，消化产物电泳分离，与完全非甲基化阴性对照组比较，得出序列中特异位点甲基化水平(图4参考引文[31]并略加修改)。

这种方法的优点有：1.方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列；2.可以进行甲基化水平的定量研究；3.需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析[32]。缺点是：1.只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA 中存在甲基化的可能[5]；2.由于酶和PCR的使用，只能分析一种特定序列[5]。

2.6 甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）

甲基化敏感性单链构象分析（MS-SSCA）又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）（BiPS），由Maekawa等1999年[32]报道。方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷

酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA 电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA 的空间构象，而后者又由DNA 碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA 将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确（见图5）：

图5：甲基化敏感性单链构象分析（MS-SSCA）示意图。重亚硫酸盐处理DNA 后，设计引物（非CG二核苷酸区）对处理后的DNA 进行扩增,产物解链后行聚丙酰胺凝胶电泳，由于甲基化和非甲基化单链DNA 形成不同的空间构象，它们在电泳中移动速率不同，故出现在不同位置，从而判定待测片段中甲基化情况。

这种方法的优点是：1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；2.能够对甲基化的等位基因进行半定量；3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性；