微生物工程实验指导(2010-2011)

的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。 4. 同时测定该发酵液的A600值。

5. 离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入95℃烘箱烘

干12h。

6. 取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到m菌1，m菌2。 五、 数据记录

记录：m空1，m空2, m菌1，m菌2, A600 计算：m空均=（m空1+ m空2）/2 m菌均=（m菌1+ m菌2）/2 菌体干重= m菌均- m空均

单位菌体干重=菌体干重×1000/10（g/L）

菌体干重除以A600即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时，只要测得A600就可以计算出菌体干重。

实验五：双缩脲法测定蛋白质含量

一、 实验目的

了解双缩脲法测定蛋白质含量的原理，掌握测定方法。 二、 实验原理

蛋白质含有2个以上的肽键，在碱性条件下与Cu2+形成紫红色络合物，该紫红色络合物颜色深浅与蛋白质含量成正比，与蛋白质的相对分子质量和氨基酸组成无关，可用于测定蛋白质的含量。

三、 双缩脲试剂：取CuSO4·5H2O2.0g和酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）

6.0g溶于500ml蒸馏水中，搅拌加入10%NaOH溶液300ml，用水稀释至1000ml。

标准蛋白质溶液：取结晶牛血清蛋白，用0.15mol/LNaCl配制成10μg /ml蛋白溶液10ml。 可见分光光度计 四、 实验操作

1. 标准曲线方程的制作

试管中分别加入标准蛋白质溶液0ml,0.2 ml,0.4 ml,0.6 ml,0.8 ml,1.0 ml，用蒸馏水补足到1ml，得到0μg /ml，2μg /ml，4μg /ml，6μg /ml，8μg /ml，10μg /ml的标准蛋白溶液。加入双缩尿试剂4ml，充分混匀后，30℃保温15min，在540nm波长处测定吸光度A540（用蒸馏水做空白），每组重复两次，以蛋白质浓度为横坐标，A540值为纵坐标，作标准曲线图，根据曲线找出吸光度与浓度对应关系，求出标准曲线方程。 2. 测定上清液中的蛋白质含量

取大肠杆菌发酵液10ml,3000r/min离心15min,得到上清液。取1ml上清液，加入4ml双缩脲试剂，充分混匀后，室温下放置15min，在540nm波长处测定吸光度A540，查标准曲线回归方程求的蛋白质含量。

五、 数据记录

1. 记录标准曲线数据

0 1 2 3 4 5 样品号 2 4 6 8 10 蛋白质浓度/(μg 0 /ml) A540 2.记录样品蛋白A540 3.计算

根据标准曲线测定数据，计算出标准曲线回归方程

将测定的A540代入标准曲线方程计算得到样品的蛋白质含量。

实验六：还原法测定无机磷

一、 实验目的

学会应用比色法测定无机磷含量的方法 二、 实验原理

磷酸根与钼酸铵在还原剂作用下，将高价铜还原成铜显蓝色，在一定浓度范围内蓝色的深浅与溶液中的磷含量呈线性关系，可以用比色法来测定。

三、 器材与试剂

磷酸标准溶液：准确称取预先在105℃烘至恒重的KH2PO4(分析纯)0.4394g，用蒸馏水溶解后定容至100ml即成含磷量1mg/ml的标准溶液，使用时将该溶液再稀释100倍，此稀释液含磷10μg /ml。

定磷试剂：6mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1:2:1:1（V/V）。此试剂要现用现配，配好时试剂应呈黄绿色或黄色，如呈棕黄色或深绿色应弃去。

催化剂：CuSO4·5H2O：K2SO4=1:4(W/W),研成细末备用。 浓硫酸，30%过氧化氢

可见分光光度计，恒温水浴 四、 实验操作

1. 标准曲线制作

按表1在各试管中分别加入不同量的10μg /ml的磷酸盐标准溶液和试剂，充分摇匀后于45℃水浴保温20min，在分光光度计上测A660

表1 标准曲线制作试剂加入量

管号 10μg /ml含磷量/水/ml 定磷试剂45℃水浴

磷酸盐标（μ/ml 保温准溶液/ml g .ml-1） 20min

1 0 0 3.0 3.0 2 0.5 5 2.5 3.0 3 1.0 10 2.0 3.0 4 1.5 15 1.5 3.0 5 2.0 20 1.0 3.0 6 2.5 20 0.5 3.0 以各管的含磷量做横坐标，A660为纵坐标做出标准曲线。 2. 发酵液无机磷的测定

① 取发酵液10ml，在3000r/min离心10min得到上清液。 ② 取5ml上清液于50ml容量瓶中，加入10%三氯乙酸2ml，震摇5min,加蒸馏水稀释至刻度。 ③ 用定性滤纸过滤，将滤液适当稀释到5-20μg /ml。 ④ 在试管中分别加入稀释后的上清液1ml，水2ml和定磷试剂3ml，充分摇匀后于45℃水浴保温20min，在分光光度计上测A660，空白为蒸馏水3ml加定磷试剂3ml

五、 数据记录

1. 记录标准曲线制作数据 管号 1 2 3 4 5 6 磷浓度/μ g A660 2. 记录样品的A660 3. 计算：发酵液磷含量（μg /ml）=计算的磷含量×10×稀释倍数

实验七：无细胞抽提液的制备

一、 实验目的

学习超声波破碎细胞的方法，了解超声波功率大小和处理时间与破碎效率的关系。 二、 实验原理

制备无细胞抽提液首先要将细胞破碎，现在常用的方法是超声破碎。超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，它又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、

4

高压（可达500×10Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 三、 器材与试剂

生理盐水：用分析纯NaCl配制成0.85% NaCl溶液500ml。

PED缓冲液：称取KH2PO4 10.2g，DTT（中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2） 0.31g，EDTA·Na2 （乙二胺四乙酸二钠盐）0.37g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml,pH7.0。

KS-F 超声波细胞破碎仪，高速冷冻离心机 四、 实验操作

① 取发酵液100ml在4℃条件下，8000r/min，冷冻离心10min,弃去上清液，得到湿菌体。 ② 用生理盐水20ml洗涤菌体，洗涤时用搅棒搅动，使充分洗去培养基，再在4℃，8000r/min，冷冻离心10min，重复2次。得到洗涤后的湿菌体。 ③ 将处理好的菌体悬浮于PED缓冲液20ml(缓冲液用量可根据菌量而变化)搅拌均匀。 ④ 冰浴中用超声波破碎：工作功率：400W，工作时间：3s,间歇时间：6s,工作次数50次。 ⑤ 冷冻离心：4℃，10000r/min，离心30min,上清液即为无细胞粗酶提液。

五、 数据记录

100ml发酵液离心得到的噬菌体质量（g），超声波破碎仪工作次数

实验八：发酵菌种的自然选育

一、实验目的

1. 学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法。 2. 熟悉无菌操作技术。 二、实验原理

土壤是微生物生长的大本营，水体是微生物生长的第二场所。工业微生物菌种最初都来自于自然界。但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起，