生物化学精要

1.角蛋白

角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋白，是由动物的表皮衍生而来的。它包括皮肤的表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分为两类，一类是α角蛋白，胱氨酸含量丰富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高达22％；另一类是β角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量很高，蚕丝丝心蛋白就属于这一类。α角蛋白，如头发，暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍，冷却干燥后又收缩到原来长度。β角蛋白则无此变化。

头发主要是由α角蛋白构成的。三股右手螺旋形成左手超螺旋，称为原纤维，直径2纳米。原纤维再排列成“9＋2”的电缆式结构，称为微纤维，直径8纳米。成百根微纤维结合成不规则的纤维束，称大纤维，直径200纳米。头发周围是鳞状细胞，中间是皮层细胞。皮层细胞的直径是20微米，是由许多大纤维沿轴向平行排列而成的。 2.胶原

胶原是动物体内含量最丰富的结构蛋白，构成皮肤、骨胳、软骨、肌腱、牙齿的主要纤维成分。胶原共有4种，结构相似，都由原胶原构成。其一级结构中甘氨酸占1/3，脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸含量也较高。赖氨酸可用来结合糖基。原胶原是一个三股的螺旋杆，是由三股特殊的左手螺旋构成的右手超螺旋。这种螺旋的形成是由于大量的脯氨酸和甘氨酸造成的。羟脯氨酸和羟赖氨酸的羟基也参与形成氢键，起着稳定这种结构的作用。羟脯氨酸和羟赖氨酸都是蛋白合成后经羟化酶催化而羟化的。在胶原中每隔2个残基有一个甘氨酸，只有处于甘氨酸氨基端的脯氨酸才能被羟化。羟化是在脯氨酰羟化酶的催化下进行的，这个酶需要维生素C使其活性中心的铁原子保持亚铁状态。缺少维生素C会使羟化不完全，胶原熔点低，不能正常形成纤维，造成皮肤损伤和血管脆裂，引起出血、溃烂，即坏血病。所以维生素C又叫抗坏血酸。

成纤维细胞合成原胶原的前体，并分泌到结缔组织的细胞外空间，形成超螺旋结构，再经酶切，即成原胶原。原胶原之间平行排列，互相错开1/4，构成胶原的基本结构。一个原胶原的头和另一个原胶原的尾之间有40纳米的空隙，其中填充磷酸钙，即骨的无机成分。 胶原的特殊的结构和组成使它不受一般蛋白酶的水解，但可被胶原酶水解。在变态的蝌蚪的尾鳍中就含有这种酶。 3.弹性蛋白

能伸长到原来长度的几倍，并可很快恢复原来长度。在韧带、血管壁等处含量较大。

含1/3的甘氨酸，脯氨酸和赖氨酸也较多。羟脯氨酸和羟赖氨酸含量很少。弹性蛋白形成的螺旋由两种区段组成，一种是富含甘氨酸、脯氨酸和缬氨酸的左手螺旋，一种是富含丙氨酸和赖氨酸的右手α螺旋。赖氨酸之间形成锁链素或赖氨酰正亮氨酸，使链间发生交联，具有很大的弹性。因为锁链素可连接二、三或四条肽链，形成网状结构，所以弹性蛋白可向各个方向作可逆伸展。 4.肌球蛋白和肌动蛋白

两种可溶性纤维蛋白，构成肌肉的主要成分。前者构成粗丝，后者构成细丝。细丝沿粗丝的滑动导致肌肉的伸缩，引起肌体动作。这一过程需要其它物质的参与和ATP供能。 （二）球状蛋白 1.肌红蛋白

肌肉中用来储存氧。海洋哺乳动物的肌肉中含大量肌红蛋白，因而可长时间潜水。抹香鲸每千克肌肉中含80克肌红蛋白，比人高10倍，所以其肌肉呈棕色。

分子量16700，单结构域。由8段α螺旋构成一个球状结构，亲水基团多在外层。血红素辅基位于一个疏水洞穴中，这样可避免其亚铁离子被氧化。亚铁离子与卟啉形成4个配位键，第五个配位键与93位组氨酸结合，空余的一个配位键可与氧可逆结合。其氧合曲线为双曲线。 2.血红蛋白

由4个亚基构成一个四面体构型，每个亚基的三级结构都与肌红蛋白相似，但一级结构相差较大。成人主要是HbA，由两个α亚基和两个β亚基构成，两个β亚基之间有一个DPG（二磷酸甘油酸），它与β亚基形成6个盐键，对血红蛋白的四级结构起着稳定的作用。因为其结构稳定，所以不易与氧结合。当一个亚基与氧结合后，会引起四级结构的变化，使其它亚基对氧的亲和力增加，结合加快。反之，一个亚基与氧分离后，其它亚基也易于解离。所以血红蛋白是变构蛋白，其氧合曲线是S形曲线，只要氧分压有一个较小的变化即可引起氧饱和度的较大改变。这有利于运输氧，肺中的氧分压只需比组织中稍微高一些，血红蛋白就可以完成运氧工作。

第五节 蛋白质结构与功能的关系

蛋白质多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。这不仅需要一定的结构还需要一定的空间构象。蛋白质的空间构象取决于其一级结构和周围环境，因此研究一级结构与功能的关系是十分重要的。 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）种属差异

对不同机体中表现同一功能的蛋白质的一级结构进行详细比较，发现种属差异十分明显。例如比较各种哺乳动物、鸟类和鱼类等胰岛素的一级结构，

发现它们都是由51个氨基酸组成的，其排列顺序大体相同但有细微差别。不同种属的胰岛素其差异在A链小环的8、9、10和B链30位氨基酸残基。说明这四个氨基酸残基对生物活性并不起决定作用。起决定作用的是其一级结构中不变的部分。有24个氨基酸始终不变，为不同种属所共有。如两条链中的6个半胱氨酸残基的位置始终不变，说明不同种属的胰岛素分子中AB链之间有共同的连接方式，三对二硫键对维持高级结构起着重要作用。其他一些不变的残基绝大多数是非极性氨基酸，对高级结构起着稳定作用。

对不同种属的细胞色素C的研究同样指出具有同种功能的蛋白质在结构上的相似性。细胞色素C广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，是一种含血红素辅基的单链蛋白，由124个残基构成，在生物氧化反应中起重要作用。对100个种属的细胞色素C的一级结构进行了分析，发现亲缘关系越近，其结构越相似。人与黑猩猩、猴、狗、金枪鱼、飞蛾和酵母的细胞色素C比较，其不同的氨基酸残基数依次为0、1、10、21、31、44。细胞色素C的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。根据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。 （二）分子病

蛋白质分子一级结构的改变有可能引起其生物功能的显著变化，甚至引起疾病。这种现象称为分子病。突出的例子是镰刀型贫血病。这种病是由于病人血红蛋白β链第六位谷氨酸突变为缬氨酸，这个氨基酸位于分子表面，在缺氧时引起血红蛋白线性凝集，使红细胞容易破裂，发生溶血。血红蛋白分子中共有574个残基，其中2个残基的变化导致严重后果，证明蛋白质结构与功能有密切关系。

用氰酸钾处理突变的血红蛋白(HbS)，使其N端缬氨酸的α氨基酰胺化，可缓解病情。因为这样可去掉一个正电荷，与和二氧化碳结合的血红蛋白相似，不会凝聚。现在正寻找低毒试剂用以治疗。 （三）共价修饰

对蛋白质一级结构进行共价修饰，也可改变其功能。如在激素调节过程中，常发生可逆磷酸化，以改变酶的活性。 （四）一级结构的断裂

一级结构的断裂可引起蛋白质活性的巨大变化。如酶原的激活和凝血过程等。

凝血是一个十分复杂的过程。首先是凝血因子XII被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原激活，然后通过一系列连续反应，激活凝血酶原，产生有活性的凝血酶。凝血酶从纤维蛋白中切除4个酸性肽段，减少分子中的负电荷，使其变成不溶性的纤维蛋白，纤维蛋白再彼此聚合成网状结构，最后形成血凝块，堵塞血管的破裂部位。

根据激活凝血因子X的途径，可分为内源途径和外援途径。前者只有血浆因子参与，后者还有血浆外的组织因子参与，一般是机体组织受损时释放的。内源途径中凝血因子XII被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原纤维激活，也可被玻璃、陶土、棉纱等异物激活。凝血因子XIIa激活凝血因子XI，此时接触活化阶段完成，反应转移到血小板表面进行，称为磷脂胶粒反应阶段，产生凝血因子Xa，最终激活凝血酶。最后一个阶段是凝胶生成阶段，产生凝块。

二、蛋白质的变构现象－高级结构变化对功能的影响

有些小分子物质（配基）可专一地与蛋白质可逆结合，使蛋白质的结构和功能发生变化，这种现象称为变构现象。变构现象与蛋白质的生理功能有密切联系。如血红蛋白在运输氧气时，就有变构现象发生。

血红蛋白是四聚体，每个亚基含一个血红素辅基。血红素中的二价铁原子能与氧可逆结合，并保持铁的价数不变。影响血红蛋白氧的饱和百分数的主要因素是氧分压和血液pH值。饱和度与氧分压的关系呈S形曲线，而单亚基的肌红蛋白则为简单的双曲线。S形曲线说明，第一个亚基与氧结合后增加其余亚基对氧的亲和力，而第二、第三个亚基与氧结合同样增加剩下亚基对氧的亲和力。第四个亚基对氧的亲和力是第一个亚基的300多倍。反之，当氧分压降低时，一个氧分子从完全氧和的血红蛋白中解离出来以后，将加快以后的氧分子的释放。

血红蛋白在一定的氧分压下，氧的饱和百分数随pH升高而增加。其原因是当血红蛋白与氧结合时，由于亚基的相互关系改变而发生解离，每结合一分子氧，释放一个质子。pH对氧-血红蛋白的平衡影响称为波尔(Bohr)效应。由于波尔效应，血红蛋白除运输氧以外，还有缓冲血液pH值的作用。

HbO2+H++CO2=HbH+CO2+O2

氧合曲线也受到温度的影响。温度升高会使P50（一半血红蛋白被氧饱和时的氧分压）升高，即亲和力减弱。所以鱼类在温度升高时会缺氧，是由于水中氧分压的降低和血红蛋白对氧亲和力的减弱双重作用的结果。

氧的S型曲线结合和波尔效应使血红蛋白的输氧能力达到最高。血红蛋白可在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，使机体内氧水平不会发生很大起伏。血红蛋白的变构现象使它具有上述优越性。

第六节 蛋白质的性质

一、蛋白质的分子量测定

（一）根据化学组成测定最低分子量

用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白

含铁0.335%，其最低分子量可依下式计算： 最低分子量＝铁的原子量÷铁的百分含量×100

计算结果为16700，与其他方法测定结果极为接近，可见肌红蛋白中只含一个铁原子。真实分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n＝1。血红蛋白铁含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因为含4个铁原子，所以n＝4，因此其真实分子量为66800。有时蛋白质分子中某种氨基酸含量很少，也可用这种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000，所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量。 （二）渗透压法

在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白质的分子量。但是实际的高分子溶液与理想溶液有较大偏差，当蛋白质浓度不大时，可用以下公式计算： M=RT/lim(Π/C)

其中R是气体常数(0.082)，T是绝对温度，Π是渗透压（以大气压计），浓度单位是g/L。测定时需测定几个不同浓度的渗透压，以Π/C对C作图并外推求出C为零时的Π/C值，带入公式求出分子量。此方法简单准确，与蛋白质的形状和水化程度无关，但要求样品均一，否则测定结果是样品中各种蛋白的平均分子量。 （三）沉降分析法

蛋白质在溶液中受到强大离心力作用时，如其密度大于溶液密度，就会沉降。用超速离心机（每分钟6－8万转）测定蛋白质的分子量有两种方法：沉降速度法和沉降平衡法。

1.沉降速度法 离心时，蛋白质移动，产生界面，界面的移动可用适当的光学系统观察和拍照。当离心力与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值，称为沉降系数。蛋白质的沉降系数（常用S20,w表示）介于1×10-13到200×10-13秒，1×10-13秒称为一个漂浮单位或斯维德贝格单位。蛋白质的沉降系数与分子形状有关，所以测定分子量时还要测定有关分子形状的参数，如扩散系数。可用以下公式计算： M=RTs÷D(1－Vρ)

其中D是扩散系数，V是蛋白质的偏微分比容，ρ是溶剂的密度。偏微分比容的定义是：当加入1克干物质于无限大体积的溶剂中时，溶液的体积增量。蛋白质溶于水的偏微分比容约为0.74立方厘米每克。为获得准确结果，s和D的值应外推到无限稀释。其中的R是气体常数，在采用厘米.克.秒制时，等于8.314×107尔格/秒。

沉降分析还可鉴定蛋白均一性。纯蛋白只有一个界面，在沉降分析图形上只有一个峰。

2.沉降平衡法 在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量：

M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]

其中C2和C1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低（8000－20000转每分）。但要达到平衡常常需要几天时间。 （四）分子排阻层析法

层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。此方法较简单，但与分子形状有关。测分子量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。 lgM＝K1－K2 Ve

其中Ve是洗脱体积，即从加样到出峰时流出的体积，K1和K2是常数，随实验条件而定。 （五）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形状有关，加入SDS后，每克蛋白可结合1.4克SDS，将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应，相对迁移率μR与分子量有如下关系： lgM=K1－K2μR

其中K1和K2是与试验条件有关的常数。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不适宜采用这个方法，如带电荷较多的（组蛋白），带较大辅基的（糖蛋白），结构特殊的（胶原）等。 二、蛋白质的酸碱性

蛋白质是两性电解质，分子中的可解离基团主要是侧链基团，也包括末端氨基和羧基。蛋白质也有等电点，即所带净电荷为零的pH值。多数蛋白等电点为中性偏酸，约5左右。偏酸的如胃蛋白酶，等电点为1左右；偏碱的如鱼精蛋白，约为12。

蛋白质在等电点时净电荷为零，因此没有同种电荷的排斥，所以不稳定，溶解度最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、膨胀性以及导电能力均

为最小。

天然球状蛋白的可解离基团大部分可被滴定，因为球状蛋白的极性侧链基团大都分布在分子表面。有些蛋白的部分可解离基团不能被滴定，可能是由于埋藏在分子内部或参与氢键形成。通过滴定发现可解离基团的pK’值与相应氨基酸中很接近，但不完全相同，这是由于受到邻近带电基团的影响。

蛋白质的滴定曲线形状和等电点在有中性盐存在的情况下，可以发生明显的变化。这是由于分子中的某些解离基团可以与中性盐中的阳离子如钙、镁或阴离子如氯、磷酸根等相结合，因此观察到的等电点在一定程度上决定于介质中的离子组成。没有其他盐类存在下，蛋白质质子供体解离出的质子与质子受体结合的质子数相等时的pH称为等离子点。等离子点对每种蛋白质是一个常数。

各种蛋白的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，在一电场作用下移动的方向和速度也不同，所以可用电泳来分离提纯蛋白质。 三、蛋白质的胶体性质

蛋白质是大分子，在水溶液中的颗粒直径在1－100纳米之间，是一种分子胶体，具有胶体溶液的性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳、不能透过半透膜及吸附能力等。利用半透膜如玻璃纸、火胶棉、羊皮纸等可分离纯化蛋白质，称为透析。蛋白质有较大的表面积，对许多物质有吸附能力。多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，亲水性强，易吸附水分子，形成水化层，使蛋白溶于水，又可隔离蛋白，使其不易沉淀。一般每克蛋白可吸附0.3到0.5克水。分子表面的可解离基团带相同电荷时，可与周围的反离子构成稳定的双电层，增加蛋白质的稳定性。蛋白质能形成稳定胶体的另一个原因是不在等电点时具有同种电荷，互相排斥。因此在等电点时易沉淀。 四、蛋白质的变性(denaturation)

1.定义：天然蛋白因受物理或化学因素影响，高级结构遭到破坏，致使其理化性质和生物功能发生改变，但并不导致一级结构的改变，这种现象称为变性，变性后的蛋白称为变性蛋白。二硫键的改变引起的失活可看作变性。

能使蛋白变性的因素很多，如强酸、强碱、重金属盐、尿素、胍、去污剂、三氯乙酸、有机溶剂、高温、射线、超声波、剧烈振荡或搅拌等。但不同蛋白对各种因素的敏感性不同。

2.表现：蛋白质变性后分子性质改变，粘度升高，溶解度降低，结晶能力丧失，旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。 变性蛋白易被水解，即消化率上升。同时包埋在分子内部的可反应基团暴露出来，反应性增加。 蛋白质变性后失去生物活性，抗原性也发生改变。

这些变化的原因主要是高级结构的改变。氢键等次级键被破坏，肽链松散，变为无规卷曲。由于其一级结构不变，所以如果变性条件不是过于剧烈，在适当条件下还可以恢复功能。如胃蛋白酶加热至80－90℃时，失去活性，降温至37℃，又可恢复活力，称为复性（renaturation）。但随着变性时间的增加，条件加剧、变性程度也加深，就达到不可逆的变性。 3.影响因素

1)温度：多数酶在60℃以上开始变性，热变性通常是不可逆的，少数酶在pH6以下变性时不发生二硫键交换，仍可复性。多数酶在低温下稳定，但有些酶在低温下会钝化，其中有些酶的钝化是不可逆的。如固氮酶的铁蛋白在0－1℃下15小时就会失活一个可能的原因是寡聚蛋白发生解聚如TMV的丙酮酸羧化酶。

2) pH：酶一般在pH 4－10范围较稳定。当pH超过pK几个单位时，一些蛋白内部基团可能会翻转到表面，造成变性。如血红蛋白中的组氨酸在低pH下会出现在表面。

3)有机溶剂：能破坏氢键，削弱疏水键，还能降低介电常数，使分子内斥力增加，造成肽链伸展、变性。 4)胍、尿素等：破坏氢键和疏水键。硫氰酸胍比盐酸胍效果好。

5)某些盐类：盐溶效应强的盐类，如氯化钙、硫氰酸钾等，有变性作用，可能是与蛋白内部基团或溶剂相互作用的结果。 6)表面活性剂：如SDS-、CTAB+、triton等，triton因为不带电荷，所以比较温和，经常用来破碎病毒。 4.变性蛋白的构象

胍和尿素造成的变性一般生成无规卷曲，如果二硫键被破坏，就成为线性结构。胍的变性作用最彻底。热变性和酸、碱造成的变性经常保留部分紧密构象，可被胍破坏。高浓度有机溶剂变性时可能发生螺旋度上升，称为重构造变性。 5.复性

根据蛋白质结构与变性程度和复性条件不同，复性会有不同结果。有时可以完全复性，恢复所有活力；有时大部分复性，但保留异常区；有些蛋白结构复杂，有多种折叠途径，若无适当方法，会生成混合物。 6.变性的防止和利用

研究蛋白质的变性，可采取某些措施防止变性，如添加明胶、树胶、酶的底物和抑制剂、辅基、金属离子、盐类、缓冲液、糖类等，可抑制变性作用。但有些酶在有底物时会降低热稳定性。有时有机溶剂也可起稳定作用，如猪心苹果酸脱氢酶，在25℃下保温30分钟，酶活为50％；加入70％